[发明专利]一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用

权利要求书

1.一种鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将鸭肝炎病毒在9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿囊腔接种进行增殖，收集36～60h内死亡并且胚体有明显病变的尿囊液，将尿囊液反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清；

(2)将步骤(1)得到的上清与等量氯仿相混合，4℃作用1h后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次；

(3)将步骤(2)中经氯仿离心处理后的上清在40000r/m下离心2h，用PBS溶解沉淀得到鸭肝炎病毒免疫原。

2.如权利要求1所述的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述鸭肝炎病毒为血清1型鸭肝炎病毒CH60株或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株。

3.如权利要求1所述的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述PBS的用量为：20ml尿囊液对应使用0.5ml PBS，鸭肝炎病毒免疫原含量为1500μg/ml。

4.一种鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，以上述权利要求1～3任一项所述鸭肝炎病毒免疫原为抗原，包括以下步骤：

(1)将弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂在研钵中研磨均匀，然后边磨边加入抗原，研磨充分后得到免疫注射液；

(2)用弗氏完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液1ml在免疫动物背部皮下多点注射进行第一次免疫；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

间隔7～10d后，用弗氏不完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液2ml进行第二次免疫，免疫途经和部位与第一次免疫相同；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

(3)间隔7～10d后，进行第三次免疫，免疫注射液、免疫剂量和注射方法与第二次免疫相同；

(4)间隔7～10d后用生理盐水稀释鸭肝炎病毒免疫原至其抗原浓度为500μg/ml，采用耳缘静脉缓慢注射方式进行第四次免疫，免疫剂量为1ml；

(5)7d以后，用琼脂扩散法测定血清效价，当免疫动物的琼扩效价达到1:32及以上时，颈动脉无菌采血分离血清，-20℃保存，即为粗制鸭肝炎病毒高免血清。

5.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(5)之后还包括步骤：

(6)取所述粗制鸭肝炎病毒高免血清按1:1～10:1比例加入鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂，充分混匀，37℃感作2h，取出，1200转/min离心，取上清；重复上述操作，每次获得上清用琼脂扩散法测定血清效价，当琼脂沉淀线为单一条带且血清效价不再下降，所获得的血清上清即为鸭肝炎病毒高免血清。

6.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述不完全弗氏佐剂的制备过程为：将石蜡油和羊毛脂按体积比为1:5的比例混合，用超声波使之混匀，高温灭菌后得到。

7.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，注射液研磨充分的判断标准为：成均匀的乳白色油包水状态的液体，取一滴该液体置于冰水上3～5min不扩散。

8.如权利要求5所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂为9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿的尿囊液按常规方法直接真空冷冻干燥获得。

9.权利要求4～8任一项所述制备方法得到的鸭肝炎病毒高免血清在鸭肝炎病毒诊断、检测中的应用。