[发明专利]一种运动发酵单胞菌原生质体的制备与再生方法

权利要求书

1.一种运动发酵单胞菌原生质体的制备方法，包括下述步骤：

步骤一，制备Z.mobilis斜面培养基：

将Z.mobilis培养基装入试管，每个试管装入培养基的体积为15mL，倾斜放置成斜面培养基备用；

步骤二，活化菌体：

取保存有Z.mobilis菌种干粉的安瓿管，安瓿管内Z.mobilis干粉的质量为1.00g，用浸过75％(v/v)酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端至红色，滴1.00mL无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿管顶端，用无菌吸管吸取0.50mL的无菌水，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使菌体溶解呈悬浮状得到菌体悬浮液，在步骤一中每个试管斜面培养基上涂布250.00μl菌体悬浮液，30-35℃无氧条件下培养48-72h，得到菌体：

步骤三，制备种子培养液：

取步骤二中得到的菌体接种于新鲜细菌液体培养基中，30-35℃，厌氧条件下，静置培养12h，获得种子培养液；

步骤四,细胞壁的酶解

取步骤三中得到的种子培养液100.00μl转入1mL新鲜细菌液体培养基中静置培养12h，再加入浓度为1.00-10.00g/l的甘氨酸溶液3.00mL，然后将全部液体离心收集菌体，具体地，先用1.00mL的P液洗涤1次，离心收集菌体，再将收集的菌体移入10.00mL浓度为0.80g/l的EDTA高渗溶液中，30-35℃，预处理30min，再次离心收集菌体；向收集的菌体中加入2.00mL的P液，振荡，制成悬浮液，向悬浮液中加入10.00mL溶菌酶液，30-35℃酶解12h，得到酶解液；所述溶菌酶液中溶菌酶中的作用浓度为1.00-10.00g/l；

步骤五,原生质体悬浮液的制备：

将步骤四得到的酶解液离心，使得原生质体与酶解液分离；弃其上清液，用1.00-2.00mL的S液，离心洗涤2-3次，收集的原生质体重悬于1.00mL的S液中得到原生质体悬浮液；

其中：

所述P液的组成为：0.30mol氯化钾，0.30mol蔗糖，磷酸缓冲液1000.00mL，pH6.0；

所述S液的组成为：蔗糖180.00-200.00g，葡萄糖20.00-30.00g，酵母膏5.00-10.00g，磷酸二氢钾1.00-2.00g，硫酸镁1.00-2.00g，蒸馏水1000.00mL，pH6.0；

所述溶菌酶液的组成为：溶菌酶1.00-10.00g，S液1000.00ml；

所述EDTA溶液的组成为：EDTA 0.80g，P液1000.00mL；

所述新鲜细菌液体培养基的组成为：葡萄糖100.00g，酵母膏5.00g，磷酸二氢钾1.00g，硫酸镁0.50g，硫酸铵1.00g，蒸馏水1000.00mL。

2.根据权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中Z.mobilis培养基的配制方法为：称取葡萄糖10.00g，酵母膏0.50g，磷酸二氢钾0.10g，硫酸镁0.05g，硫酸铵0.10g，琼脂粉2.00g，蒸馏水加至100.00mL，121℃条件下高压灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述Z.mobilis菌种从土壤中分离所得，经冷冻干燥成干粉状保存于安瓿管中。

4.根据权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述的培养基和溶液均于高压灭菌锅中121℃，100KPa的条件下灭菌30min后使用。

5.一种利用权利要求1所述方法制备产生的一种运动发酵单胞菌原生质体的再生方法，其特征在于，利用双层培养基，其中上层为半固体再生培养基，下层为固体再生培养基，将原生质体悬浮液用S液稀释100倍，取400.00μl加入固体再生培养基，用涂布器均匀涂布后，加入冷却至40℃的半固体再生培养基覆盖，置30-35℃培养5-7天；

所述S液的组成为：蔗糖180.00-200.00g，葡萄糖20.00-30.00g，酵母膏5.00-10.00g，磷酸二氢钾1.00-2.00g，硫酸镁1.00-2.00g，蒸馏水1000.00mL，pH6.0。