[发明专利]一种牛皮明胶的定量检测方法

权利要求书

1.一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：

A、牛皮明胶酶解

（1）加入碳酸氢氨溶液配制牛皮明胶溶液；

（2）加入胞内蛋白酶 Lys-C，使牛皮明胶酶解；

（3）再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解；

B、同位素标记

（1）加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；

（2）冻干;

（3）进一步去除水分；

（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H₂¹⁶O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H₂¹⁸O，进行标记； 

C、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测

（1）将标记物和未标记物混合；

（2）上样检测：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解物中H₂¹⁶O标记的特征峰和H₂¹⁸O标记的特征峰，上样量为0.5-20μg；

D、数据分析

（1）根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰；

（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰面积；

（3）定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即¹⁸O/¹⁶O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，¹⁸O/¹⁶O按照如下公式计算：

                  

其中，I₀, I₂ 和 I₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；M₀, M₂ 和 M₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。

2.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：

所述牛皮明胶溶液的配比中加入10 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到1 mg/ml的牛皮明胶溶液；

所述加入胞内蛋白酶酶解时，胞内蛋白酶与牛皮明胶质量比mg/mg 为1:100，酶解温度为37 ℃，反应时间为4 h；

所述再加入胰蛋白酶酶解时，胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:50，酶解温度为37 ℃，反应时间为12 h。

3.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：

所述同位素标记中胰蛋白酶和牛皮明胶质量比为1:100-1:1；

所述冻干温度为-30至-80℃，冻干时间为2-24h;

所述进一步去除水分的条件是：加入20-200μl色谱乙腈，常温下真空干燥10-60min；

所述标记中H₂¹⁶O或H₂¹⁸O与牛皮明胶酶解物的质量比为10:1-100:1，标记所需温度为10-60℃,时间为3-48h。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为591.7974^2+-591.8374²⁺，相应的氨基酸序列为EGPVGL*PGIDGR，其中*表示P被羟基化，经¹⁸O标记后，特征峰的质荷比变成593.7974^2+-593.8374^2+，氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧基末端两个¹⁶O原子被¹⁸O代替。