[发明专利]一种铁皮石斛组培细弱苗复壮方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术中植物组织培养方法，具体地说，涉及一种铁皮石斛壮苗或定植后细弱苗的复壮方法。

背景技术

铁皮石斛是中华九大仙草之首，有极其丰富的药用价值，野生资源极少，由于人们长期的野外采挖，野生的铁皮石斛已经到了濒危的状况。铁皮石斛坐果率很低，种子不易发芽，自然繁殖率极低。建立组培快繁体系可以从根本上解决这一问题。

迄今，铁皮石斛组培技术相关专利已经有很多，多数集中在铁皮石斛繁殖配方及种植方面，但对于铁皮石斛中期壮苗及定植后细弱苗恢复等，尚未有专业的研究及专利。本发明提出了一种铁皮石斛细弱苗的复壮方式及配方，避免在转接培养苗过程中因过多的细弱苗丢弃产生的成本浪费。

发明内容

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：

培育铁皮石斛组培苗选取铁皮石斛蒴果为外植体，经常规组培消毒后将种子撒播在原球茎诱导培养基MS+香蕉50g/L+马铃薯50g/L+蛋白胨1g/L，pH5.8；分化培养基为MS+香蕉50g/L+马铃薯50g/L+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.5mg/L；壮苗生根培养基为1/2MS(大量元素减半)+0.5mg/LNAA(萘乙酸)+50g/L香蕉+50g/L马铃薯+0.25g/L活性炭。pH为5.8。在壮苗及生根后，仍有一些茎粗达不到标准的组培苗，栽植入本壮苗培养基。因马铃薯中含淀粉成分较多，能补充必要的碳源等物质，对细弱苗复壮有积极的作用，本发明以MS为基础培养基，添加物为马铃薯80g/L，香蕉40g/L，NAA为0.4mg/L，同时调整pH为5.8，即为MS+NAA0.4mg/L+马铃薯80g/L+香蕉40g/L+琼脂粉6g/L+蔗糖30g/L。培养基在121.3℃,103.42kPa条件下灭菌20分钟，冷却凝固后待用。将细弱苗接种至复壮培养基中，放置于培养室中进行培养，光强度为人工辅助光1200LUX，自然光2000LUX，温度为20-23℃；光暗交替时间为12小时/天。培养约60天-70天。

本发明相对现有技术的有益效果为：1.此发明通过改良基础培养基配方，使得细弱苗的粗壮度提高40％。图1细弱苗转入复壮培养基及正常培养基的表现。其中A是细弱苗转入本发明培养基培养60天后的苗情况图。B是细弱苗转入正常壮苗生根培养基60天后的苗情况图。2.此发明建立了有效的铁皮石斛细弱苗复壮方法，减少了生产浪费，降低了生产成 本，提升了组培苗的有效利用率。

 具体实施方式

培养基配方筛选实施例

基本培养基为MS培养基，添加物为马铃薯与香蕉，使用四因素五水平正交设计法，马铃薯添加量为0g/L 、20g/L、40g/L、60g/L、80g/L；香蕉的添加量为0g/L、20g/L、40g/L、60g/L、80g/L，NAA加量为0 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L；6-BA的添加量为0 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、4 mg/L； pH为5.8，人工辅助光1200LUX，自然光2000LUX，光暗交替时间为12h/d。温度为18-23℃。查阅正交表设计方法共设计25组实验，其中MS+NAA0.4mg/L+马铃薯80g/L+香蕉40g/L+琼脂粉6g/L+蔗糖30g/L壮苗配方，其直径可增粗40%，达到了出苗的直径要求。

表1 四因素五水平正交设计表

结果表明：实验号23培养基即为基本培养基基础上添加NAA0.4mg/L、马铃薯80g/L、香蕉40g/L对苗复壮具有良好的效果，即培养基为MS+NAA0.4mg/L+马铃薯80g/L+香蕉40g/L+琼脂粉6g/L+蔗糖30g/L。苗直径平均增粗40%。

方法实施例：

在转接壮苗及定植苗时，选取转接过程中的细弱苗，剔除黄叶及培养基，无菌条件下将其转接入MS+NAA（萘乙酸）0.4mg/L+马铃薯80g/L+香蕉40g/L+琼脂粉6g/L+蔗糖30g/L培养基中，pH5.8，每瓶10株左右，后放入培养室中，光强度为人工辅助光1200LUX，自然光2000LUX，温度控制在20-23℃；光暗交替时间为12小时/天。培养65天后，选取5cm高，茎粗达到1.5mm-2mm的铁皮石斛苗进行移栽。移栽采用大棚设施苗床栽培，苗床约80cm高，移栽基质为松树皮，基质厚约8cm，铺于苗床上。幼苗的培养温度为20-30度，基质及空气湿度为40%-60%，成活率可达95%。