[发明专利]一种提高间苯三酚产量的基因改造方法及应用

权利要求书

1.一种提高间苯三酚产量的基因改造方法，其特征在于，是通过敲除或插入的方式获得出发菌株全局调控因子arcA基因失活的突变菌株，再将突变菌株转为感受态后导入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒，获得重组细胞。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)通过插入失活或者敲除失活的方式使出发菌株的全局调控因子基因arcA失活，获得突变菌株；

2)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞；

3)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒；

4)将步骤3)所得的重组质粒导入到步骤2)所得的感受态细胞中，获得重组细胞。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述出发菌株，是大肠杆菌。

4.权利要求3所述方法，其特征在于，所述大肠杆菌，是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase，来源于大肠杆菌。

6.权利要求5所述方法，其特征在于，所述聚酮合成酶基因phlD，GeneBank ID为11830552；所述多重抗性激活因子marA，GeneBank ID为6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase，其中，亚基accA的GeneBank ID为6062185，亚基accB的GeneBank ID为6058890，亚基accC的GeneBank ID为6058863，亚基accD的GeneBank ID为6059083。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，敲除出发菌株全局调控因子基因arcA上300bp的序列，获得突变菌株；

所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO.1所示；

2)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞；

3)将聚酮合成酶基因phlD和多重抗性激活因子marA连接到载体pET30a上，获得重组质粒pET-phlD-marA；乙酰CoA羧化酶基因ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质粒pACYC-accADBC；

所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase，来源于大肠杆菌，其中，亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083；

4)在将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC导入到步骤2)所得的感受态细胞中获得重组细胞。

8.权利要求1-7所述方法，其特征在于，用于获得高产间苯三酚的基因工程菌和生产间苯三酚。

9.权利要求8所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，敲除出发菌株全局调控因子基因arcA上300bp的序列，获得突变菌株；

所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO.1所示；

2)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞；

3)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重组质粒；

4)将步骤3)所得的重组质粒导入到步骤2)所得的感受态细胞中，获得重组细胞；

5)通过摇瓶培养或发酵罐培养步骤4)所得重组细胞生产间苯三酚。

10.权利要求9所述方法，其特征在于，步骤5)所述培养，重组细胞种子液的接种量为培养基体积的1％-5％，培养温度为37℃，搅拌速度为400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀为8-12，然后加入诱导剂IPTG至终浓度100μM，利用质量分数50-80％的葡萄糖储液继续补料发酵12-24h后结束。