[发明专利]一种光子晶体微球流式芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

    本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种光子晶体微球流式芯片检测致病菌的方法。

背景技术

病原微生物的准确检测和鉴定在临床医学、食品安全、环境监督中的作用日益凸显，传统的食源性疾病的检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，存在操作较为耗时繁琐、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点，在应对突发性食品安全公共事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。

随着分子生物学的发展，以PCR为基础的核酸扩增技术越来越成为生物检测和鉴定的最有效方法，特别是基于PCR的基因芯片技术，可以对样品中病原微生物做到一次性鉴定种属、毒力因子和基因多态性分析，这对致病菌检测提供了方便快速的方法。

虽然基因芯片技术在微生物检测方面有很多独特的优势，但还有不少问题和缺陷亟待解决。目前主要有以下几个问题制约了基因芯片技术的应用和发展：1)基因序列信息的缺乏远不能满足实际检测与诊断的需要；2)基因芯片相关技术专利的限制，减慢了基因芯片技术的普及；3)基因芯片技术是一项多学科交叉的技术，仍有很多技术问题需要改进和提高；4)目前基因芯片的制备和检测费用都很高，只能在大型实验室研究，极大地限制了其开发进展；5）无论是PCR还是基因芯片技术，均需要对目的DNA扩增，不可避免的要求在扩增目的基因前设置合适的引物，特别是多重PCR，对引物设计要求更为严格，扩增条件更为苛刻。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于扩增致病菌基因组DNA的通用引物。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种高灵敏度、成本低、检测时间快、特异性好的光子晶体微球流式芯片。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种光子晶体微球流式芯片的制备方法。

本发明最后所要解决的技术问题是提供光子晶体微球流式芯片检测致病菌的方法。

本发明的原理为：光子晶体微球(编码小球)表面用双氧水：浓硫酸溶液进行羟基化修饰，用γ- 缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，然后与5端经氨基修饰的特异性探针偶联，牛血清蛋白（BSA）封闭。偶联的探针与5端经FAM荧光素标记的通用引物扩增所得的扩增产物特异性结合。用荧光显微镜拾取微球的荧光信号，用微球的反射光谱的有无和强弱来判断检测样本中是否存在某种致病菌以及含量的多少。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测致病菌的探针，所述探针是根据致病菌的基因设计的探针，并在5'端标记氨基和poly(T)15。

一种光子晶体微球流式芯片，它包含上述的探针。

一种光子晶体微球流式芯片的制备方法，包括以下步骤：

1）光子晶体微球的制备；

2）光子晶体微球表面的修饰；

3）探针偶联：将上述的探针偶联于经步骤2）表面修饰的光子晶体微球表面得到光子晶体微球流式芯片。

其中，上述步骤1）具体步骤为：首先将甲基硅油倒入培养皿中，175℃加热10min，然后冷却至室温备用。内装二氧化硅单分散乳液的1 号注射器和内装甲基硅油的2 号注射器中的液体通过三通管连接，利用两蠕动泵分别将甲基硅油和二氧化硅单分散乳液混合包裹进入已经处理好的盛有甲基硅油培养皿，在界面力的作用下二氧化硅单分散乳液会形成球状结构；以不同纳米二氧化硅颗粒自组装技术制备上述的粒径相同的光子晶体微球，各微球具有不同的光反射光谱；将制备好的微球放入70℃烘箱中加热9h，其中的水分完全蒸发的同时也会使纳米微球进一步组装。微球成型后，使用正己烷多次清洗小球，每次冲洗前先浸泡10min，接着用无水乙醇冲洗3 次，然后再放入马弗炉中进行煅烧，升温（2℃ /min）至300℃后恒温3h，降温（1.5℃ /min）。

其中，上述步骤2）包括以下步骤：将步骤1）得到的光子晶体微球置于体积比1:5~5:1双氧水与浓硫酸中对微球表面进行羟基化修饰，再用0.01%-20%γ- 缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液对微球表面进行环氧基修饰；具体步骤如下：将光子晶体微球置于食人鱼洗液中（浓硫酸：双氧水＝2:1体积比）6h，利用去离子水清洗微球3次，并用氮气吹干；然后置于5％GPTMS甲苯溶液，常温过夜；利用甲苯清洗3次，乙醇清洗3次，灭菌水清洗3次，去除残留硅烷，氮气吹干。

其中，上述步骤3）探针偶联与封闭具体步骤如下：将洗净后的光子晶体微球与5μl(100μM)的探针4℃偶联过夜，10×PBS清洗3次，去离子水清洗2次，氮气吹干。