[发明专利]多孔树脂珠和通过使用它制备核酸的方法

说明书

本发明提供了共聚物的多孔树脂珠，所述共聚物包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元，所述多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18.5‑55mol％，和所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为60–300nm。

技术领域

本发明涉及多孔树脂珠。本发明的多孔树脂珠可用于制备核酸(尤其是不少于40个链节的多核苷酸)。

背景技术

使用亚磷酰胺法的固相合成方法广泛用于核酸(如DNA寡核苷酸或多核苷酸和RNA寡核苷酸或多核苷酸)的化学合成。在这种方法中，例如，作为待合成核酸的3’-末端的核苷预先由固相合成载体经由可切割(cleavable)连接基(如琥珀酰基团等)进行负载，且将该载体置于合成柱中，所述合成柱放置在核酸自动合成仪上。此后，通过核酸自动合成仪使合成试剂流入反应柱中，并且例如，实施以下合成工序：

(1)用三氯乙酸/二氯甲烷溶液或二氯乙酸/甲苯溶液等使核苷5’-OH基团脱保护；

(2)通过核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidite)(核酸单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑等)/乙腈溶液使亚酰胺(amidite)与所述5’-OH基团进行偶联反应；

(3)用乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反应的5’-OH基团封端；

(4)通过碘/水/吡啶等氧化亚磷酸酯。

重复前述合成工序的循环，由此合成具有目标序列的核酸。通过用氨、甲胺等水解可切割连接基(见非专利文献1)，来从固相合成载体中切割出最终合成的核酸。

无机颗粒(如CPG(可控孔度玻璃))和硅胶已经被用作用于合成核酸的固相合成载体。然而，近年来，树脂珠以低成本日益频繁地用于大规模合成中，这是因为它们能够基于每重量的固相合成载体增加核酸的合成量。已知低交联的高溶胀多孔聚苯乙烯珠是这种树脂珠(见专利文献1)。低交联的高溶胀树脂珠的特征在于可以结合作为核酸合成起点的许多连接基。另一方面，由于对各合成试剂的溶胀度高，因此可以填充在用于核酸合成的柱中的树脂珠的量变小。

而且，通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠在各种有机溶剂中的溶胀率的变化(见专利文献2)，来尝试改进核酸的合成能力。在该文献中的多孔树脂珠显示出小的在各种有机溶剂中的溶胀率变化；然而，需要对核酸合成能力作进一步地改进。

通常，成问题的是，待合成的寡核苷酸或多核苷酸的较长链长与合成能力(合成纯度和合成量)的降低相关联。为了解决该问题，需要降低作为合成固相合成载体的起点的核苷连接基的载量。例如，当需合成具有高纯度的20个链节的DNA寡核苷酸时，可商购的用于固相合成的多孔树脂珠载体的核苷连接基载量为约200μmol/g。当它是不少于40个链节的DNA多核苷酸时，其载量不超过80μmol/g。因此，不能利用低交联且高度溶胀的树脂珠的特性，所述特性是作为核酸合成起点的许多连接基可以与其结合，并且可以填充在用于核酸合成的柱中的树脂珠的数量下降，这继而降低了每单次合成所得到的合成核酸的量并且降低了生产效率。在本说明书中，寡核苷酸意为具有20个或更少链节的核苷酸聚合物，多核苷酸意为具有超过20个链节的核苷酸聚合物。

[文献列表]

[专利文献]

专利文献1：JP-A-2005-325272

专利文献2：JP-A-2008-074979

[非专利文献]

非专利文献1：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)3.6.1-3.6.13

发明内容