[发明专利]一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus)是现存个体最大的两栖动物，俗名“娃娃鱼”，是我国的珍贵特产，属于国家二级保护动物。近年来在我国的陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等省份的大鲵主养区暴发了大鲵病毒性出血病，该病可感染各种规格的养殖大鲵，死亡率高达90％以上，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。

大鲵病毒性出血病的病原为大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)，是虹彩病毒科(Iridoviridae)，蛙病毒属(Ranavirus)的成员。虹彩病毒(Iridoviruses)是一类病毒粒子较大，呈二十面体状的双链DNA病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)分为五个属：绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)，虹彩病毒属(Iridovirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，巨大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavirus)。虹彩病毒可感染无脊椎动物(绿虹彩病毒属，虹彩病毒属)及变温脊椎动物(蛙病毒属，淋巴囊肿病毒属，巨大细胞病毒属)，包括两栖类、爬行类、甲壳类、软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒，尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变温动物发病的一个重要原因。主要衣壳蛋白(Major Capsid Prote in,MCP)基因为虹彩病毒的一个晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表达，编码的主要衣壳蛋白分子量约为50kD，构成病毒的二十面体衣壳。比较虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列发现，虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列是高度保守的，同一属的同源性一般在90％以上，不同属之间的同源性一般为40％-50％左右。很多发明者针对各自虹彩病毒MCP制备疫苗，但通过体外重组表达全长MCP作为疫苗，因生产过程中MCP表达量少，导致制备成本增加。本发明通过对大鲵虹彩病毒MCP蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。

由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种大鲵虹彩病毒病疫苗，该疫苗为大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白截短优化的重组蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种大鲵虹彩病毒病疫苗的制备方法，申请人提供了一株巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP菌株，该菌株包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备大鲵虹彩病毒病疫苗。该菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2014573，分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的最后一个目的在于提供了一种大鲵虹彩病毒病疫苗在制备大鲵虹彩病毒疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种大鲵虹彩病毒病疫苗的获得：