[发明专利]一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域；涉及一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法。

背景技术

脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒感染引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病，主要影响五岁以下的儿童，脊髓灰质炎没有特效治疗方法，是全球性广泛传播的、危害极大的急性传染病，由于具有特异的病理变化，及脊髓前角灰白质细胞的损害，尤其在灰质区，故称脊髓灰质炎。临床特征为肌肉麻痹，特别是机体的弛缓性麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症(niafntelipaarylsis)，但其并非仅仅侵害幼儿，成年人中亦多有发生，主要是隐性感染，发生麻痹病例只占0.1%-1%。病毒侵犯脊髓前角运动神经元，造成弛缓性肌肉麻痹，病情轻重不一，轻者无瘫痪出现，严重者累及生命中枢而死亡。

脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，内含单股正链 RNA 基因，脊髓灰质炎病毒基因组 RNA 长约 7.5kb。基因组分为四个部分：5’端非编码区、多聚蛋白编码区、3’端非编码区和 3’端 Poly(A)尾。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为 P1、P2 和 P3 区，其中 P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白 VP1、VP2、VP3 和 VP4，P2 和 P3 区则可水解产生蛋白酶、RNA 复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。P3 区水解产生的蛋白 3C 在多聚蛋白前体加工过程中完成绝大多数裂解功能，其前体 3CD 也有 3C的活性。5 个拷贝的 VP1、VP2、VP3 和 VP4 构成了五聚体，12 个五聚体构成二十面体核壳，脊髓灰质炎病毒主要抗原位点位于结构蛋白VP1，VP2 和VP3 上。脊髓灰质炎病毒有三个血清型，即I 型、II型、III型，各型之间无交叉免疫反应。

脊髓灰质炎没有特效治疗方法，只能疫苗预防。目前有上市的有两种脊髓灰质炎疫苗，口服减毒活疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)。在我国，脊髓灰质炎疫苗属于国家免疫规划，由于成本问题，还主要使用OPV疫苗，但是由于口服炎减毒活疫苗可能有相关麻痹型脊灰（VAPP）和疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)的风险， VAPP年发生率为每100万发生0.14例，只要继续使用口服脊髓灰质炎疫苗，就不能根除脊灰，世界上很多国家使用巴斯德生产的IPV疫苗，但是IPV生产需要严格的实验条件，成本控制是很大问题，且IPV疫苗中可以检测到猿猴病毒SV40，可以使培养的细胞发生转化，并可导致动物产生肿瘤，因此需要开发新型的安全的脊髓灰质炎疫苗。

病毒样颗粒(Viruse Like Particles，VLPs)疫苗是近年来发展起来的一种新型亚单位疫苗,它是体外表达的病毒结构蛋白在特定的条件下自动装配成的在形态上类似于天然病毒的空心颗粒，内部无病毒核酸结构，没有感染性，具有病毒的天然空间构象，具有很强的免疫原性和生物学活性，因此在新型疫苗开发方面有巨大优势。目前已有人乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒的 VLPs 已经被成功研制成疫苗且已投放市场。早在1990年David和1989年Toyohiko、1992年Sandra分别成功获得了脊灰I型和III型VLPs，Toyohiko等还用纯化得到的III型VLPs免疫小鼠，能够诱导小鼠产生中和抗体。因此，针对脊髓灰质炎病毒样颗粒研究是发展脊髓灰质炎病毒疫苗的首选目标。

由于形成该类病毒VLP需要多个蛋白参与，需要构建多顺反子载体才能满足该目的。目前构建多顺反子载体的策略主要包括：

（1）多个载体共同转染细胞，是目的蛋白共表达。但该方法需要同时转染多个载体到一个细胞中，其转染效率低，载体之间互相干扰，蛋白表达不平衡。

（2）构建多启动子(multiple promotors) 表达载体。通过把多个基因分别连接不同类型的启动子下，通过各个启动子进行控制表达。但是由于不同的启动子的启动效率的差异，也会造成蛋白表达不均衡，蛋白相互作用距离较远。同时各个启动子元件较大，如果使用多个启动子就会加重载体的负担，影响转染和表达效率。