[发明专利]真皮干细胞在检测化妆品及其原料细胞毒性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及真皮干细胞在检测化妆品及其原料细胞毒性中的应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，由上皮组织和真皮组织构成，自我更新和再生修复速度快。基于对皮肤上皮干细胞的研究，20世纪90年代，国内外的多个研究小组均报道从真皮组织中分离获得真皮多能干细胞，这些细胞具有较强的增殖和分化潜能，可以分化为平滑肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞甚至神经细胞等多种组织细胞，在组织工程领域也有广泛的应用前景。

常用的细胞毒性测定方法是MTT(四唑盐)比色法，通过计算细胞的相对增殖率，进行物质的毒性评价。在实验中使用的细胞系有三大类：来源于正常组织的有限细胞系，如IMR-90、MRC-5等成纤维细胞；来源于正常组织的连续细胞系，如MDCK上皮样细胞、L929成纤维细胞、3T3-L1成纤维细胞、Vero上皮样细胞；来源于肿瘤组织的连续细胞系，如A549上皮细胞、Hela上皮细胞、HL-60悬浮细胞等。来源于正常组织的细胞系在细胞毒性评价中更具有针对性和明确性，来源于肿瘤组织的细胞可以在体外培养条件下无限增殖传代，因而，这两类细胞在体外细胞毒性的评价中得到广泛的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供真皮干细胞在检测待测样品细胞毒性中的应用；

或，真皮干细胞在制备检测待测样品细胞毒性的产品中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种检测待测样品细胞毒性的方法。

本发明提供的检测待测样品细胞毒性的方法包括如下步骤：将待测样品与真皮干细胞混合培养，用MTT法检测真皮干细胞相对增殖率，按照如下判别方法判断所述待测样品细胞毒性：

(1)若细胞相对增殖率为＜0，则判定待测样品对细胞有毒；

(2)若细胞相对增殖率为≥0，则判定待测样品对细胞无毒。

上述方法中，所述混合中，所述待测样品在混合体系中的浓度至少为0.1ug/ml。

上述方法中，在所述混合后，培养48h。

上述方法及应用中，所述待测样品为化妆品和/或化妆品原料；所述待测样品具体为熊果苷、苹果多酚、白藜芦醇、绿茶提取物、红景天提取物、乙醇、丙酮、DMSO、SDS或苯酚。

人真皮干细胞是来源于皮肤真皮层的具有无限增殖能力和自我更新能力的多能干细胞，兼备了来源于人正常组织以及无限增殖的双重特性，在体外细胞毒性的评价方面具有更加明显的优势，具有广阔的研究和开发价值。

本发明提供了一种真皮干细胞在检测化妆品及其原料细胞毒性中的应用。本发明用待检测化妆品及原料处理人皮肤来源的真皮干细胞，通过MTT比色法得出了处理后真皮干细胞的相对增殖率情况，结果表明：当待测化妆品或其原料的浓度为0.1ug/ml时，依然能检测出细胞毒性，灵敏度较高。因此，人皮肤来源的真皮干细胞可作为MTT比色法检测化妆品及原料安全性的新途径。

附图说明

图1为阳性对照物细胞毒性结果图。

图2为植物提取物细胞毒性结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的细胞为黄种人皮肤的真皮干细胞；

真皮干细胞的获得方法：将人皮肤组织经碘酊，75％酒精以及PBS杀菌清洗后，剪掉脂肪组织；在无菌环境下将皮肤剪成5mm×5mm的小块，在4℃下利用Dispase Ⅱ将组织消化过夜12-16h；将真皮和表皮组织分开，用Collagenase typeⅠ(Gibco，17100-017)和DMEM/F12混合液将真皮组织在37℃下酶处理1h；用缓冲液HBSS终止反应，将组织液先后过100μm和40μm滤膜，将上清液在4℃，360g离心8min，弃上清液；用KGM培养基将细胞悬起置于培养瓶中，加入足量的KGM⁺medium培养液，37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养；当80％细胞贴壁融合后，利用胰蛋白酶将细胞消化，用Integrinβ1和CK15对细胞进行染色标记，通过流式细胞仪进行分选，得到两种抗体荧光阳性的细胞，即为真皮干细胞。