[发明专利]基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于PCR检测病毒技术领域，涉及一种基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身或呼吸系统疾病。AIV亚型众多，根据表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差异，已鉴别出16种HA亚型(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型；根据AIV致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Lowly Pathogenic Avian Influenza Virus,LPAIV)。HPAIV引起家禽的AI以全身感染、高发病率和高死亡率为特征；LPAIV引起家禽AI的临床症状表现温和，死亡率不高，但影响家禽的生长发育和生产性能。

H4亚型AIV属于LPAIV，能隐性感染各种家禽及野生鸟类，宿主范围比较广，包括鸡、火鸡、鸭、野鸭、野鸟、鸵鸟、鹦鹉等，还可以跨种传播，感染哺乳动物。薛峰等报道，在江苏盐城国家级自然保护区对野鸭、丹顶鹤等野禽AIV检测中，H4亚型AIV分离率最高(38.5％)。虽然绝大多数LPAIV致病力低，但LPAIV可能为感染人类的AIV提供基因，潜在危害性不容忽视。因此，应加强对H4亚型AIV的监测。目前，国内已建立的快速检测方法多数都是针对其他亚型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型，而针对H4亚型AIV的快速检测方法的未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供敏感性好、特异性强和重复性好的基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，以简便快速地检测H4亚型禽流感病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。

引物1和引物2的摩尔比为1∶1。

上述H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。

PCR扩增的退火温度为65℃。

基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，包括引物对、PCR扩增缓冲液和水；

引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，其浓度均为25pmol/μL，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5pmol/μL；

PCR扩增缓冲液为2×Taq PCR Mix。

引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。

上述基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。

PCR扩增的退火温度为65℃。

针对目前缺乏对H4亚型禽流感病毒进行快速检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了一对特异性引物，据此建立了H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检测H4亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，特异性试验结果显示该法可特异性扩增出H4亚型禽流感病毒，不扩增其他常见禽病病原体；敏感性试验结果显示该法对H4亚型禽流感病毒检测下限为1.48pg/μL；对86份临床样品进行检测，临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本发明用于H4亚型禽流感病毒导致的禽类感染早期诊断及有效防制，可以节约时间的成本。

附图说明

图1是二温式RT-PCR退火温度优化结果电泳图，图中：M、DL1000 DNA Marker；1、58℃；2、59℃；3、60℃；4、61℃；5、62℃；6、63℃；7、64℃；8、65℃；9、66℃；10、67℃；11、68℃；12、阴性对照。

图2是二温式RT-PCR的特异性试验结果电泳图，图中：M、DL1000 DNA Marker；1～3为3株不同的H4亚型禽流感病毒；4～9分别为H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型AIV；10、NDV；11、IBV；12、ILTV；13、MG；14、ARV；15、阴性对照。