[发明专利]非洲猪瘟病毒基因II型毒株单克隆抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本申请涉及单克隆抗体领域，特别是涉及一种特别针对非洲猪瘟病毒基因II型毒株的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，其临床症状表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血，致死率高达100％。但也有少数毒株感染家猪后，猪只出现亚急性感染或者隐性带毒。世界动物卫生组织〔OIE〕将其列为A类动物疫病，受到世界各国的高度重视，我国尚未发生该病，我国已将此病规定为一类动物传染病，并作为动物外来疫病进行研究(孙怀昌.中国预防兽医学报,1999,21(21):117-119)。

近年来，非洲猪瘟已由非洲大陆横跨到亚欧大陆的亚美尼亚、乌克兰、俄罗斯，特别是近年来高加索地区疫情严峻，对我国造成极大威胁。非洲猪瘟在西欧、南美洲和东欧的发生已经证实，非洲猪瘟一旦传入将给养猪业带来毁灭性的打击。我国已将非洲猪瘟列入2011年国家动物疫病监测计划，确定新疆、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、西藏等为重点监测省区(王宏燕,养猪,2011,4:81-82)。

目前尚无有效的疫苗，因此通过快速诊断非洲猪瘟抗体水平来判断猪只的感染情况，从而制定有效的控制和消灭措施，进而及时准确的诊断检测和严格有效的封锁扑杀等措施是成功消灭非洲猪瘟的有效方法。非洲猪瘟抗体诊断方法包括琼脂扩散试验、ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。目前，我国诊断非洲猪瘟的检测试剂主要依赖进口，拥有自主知识产权的方法和试剂很少，加之周边国家严峻的疫情形势，我国迫切需要建立自己的检测方法和试剂。

并且，现有的抗体诊断方法中，由于采用活病毒感染细胞来制备抗原导致在临床运用时检测程序无法标准化操作，且因操作活毒风险大，因此不适合推广运用。目前用于检测方法及试剂的开发多用基因工程方法表达抗原，主要集中在如p72、p54、p32、pp62、A104R、B602L、K205R等基因的研究，其中p72、p54等应用较广。而单克隆抗体的制备也主要集中在这些结构蛋白，由此建立的基于免疫学方法的商业试剂盒目前世界范围内仅四家。但是，由于非洲猪瘟病病毒毒株间地域差异大，使得现有的商业试剂盒在使用过程中，容易出现由某 些毒株引起的非洲猪瘟病的漏检现象。

非洲猪瘟病毒基因II型毒株是目前俄罗斯境内流行的非洲猪瘟病毒，由于其地缘关系，该毒株对我国具有重大威胁；而目前尚没有特别针对该毒株的检测试剂盒，现有的商业试剂盒又存在漏检的风险。因此，根据我国与俄罗斯的地缘关系，为能准确检测到邻国俄罗斯境内非洲猪瘟病毒，亟需一种特别针对俄罗斯境内的非洲猪瘟病毒基因II型毒株的检测试剂或方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的非洲猪瘟病毒基因II型毒株的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的制备方法和应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请一方面公开了一种非洲猪瘟病毒基因II型毒株单克隆抗体的制备方法，包括采用纯化的p54免疫蛋白对小鼠进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，然后采用三种筛选抗原对阳性杂交瘤细胞株进行筛选，获得可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后通过体内或体外的方法制备非洲猪瘟病毒基因II型毒株单克隆抗体；三种筛选抗原包括，原核表达p54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白，以及人工合成的SeqID No.1所示序列的多肽；

Seq ID No.1：PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。

需要说明的是，本申请的关键在于采用三种筛选抗原对杂交瘤细胞株进行筛选，其中Seq ID No.1所示序列人工合成的多肽，是特别针对非洲猪瘟病毒基因II型毒株而设计的筛选抗原，因此，由其筛选出的杂交瘤细胞株所制备的单克隆抗体能够保障基因II型毒株的检出率；但是，由于不同毒株之间具有一定的共性，并且俄罗斯境内病毒毒株也是由其它地区或国家传入的，因此，本申请的单克隆抗体只是能够保障所有俄罗斯境内病毒毒株，即基因II型毒株都能够被检出，避免漏检，但不排除其它地域的其它部分毒株也可以检出。