[发明专利]一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的流行性乙型脑炎病毒检测试剂盒。

背景技术

流行性乙型脑炎简称乙脑，是日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的最常见的病毒性脑炎。为了与本世纪初曾流行于欧洲的昏睡性脑炎(又称甲型脑炎)相区别，解放后我国卫生部定名为流行性乙型脑炎。它曾经一度被称为“东方的瘟疫”。乙型脑炎病毒属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，基因组为单股正链RNA，两端为非编码区，整个基因组为一个开放阅读框，编码一个多蛋白质前体。流行性乙型脑炎是乙型脑炎病毒感染引起的人畜共患病，人通过蚊虫叮咬或密切接触感染。我国是乙型脑炎流行的高发地区，发病人数占全世界乙型脑炎病例的80％以上，每年报告病例有1万一2万，存活的患者多数会留下严重的神经精神后遗症。由于乙型脑炎尚无特效疗法，早期准确的诊断和有效的预防是防治本病的主要手段。因此选用简便、快速准确，便于推广使用的诊断方法对于乙型脑炎的防控具有重大意义。

目前国内外关于流行性乙型脑炎病毒检测方法一般采取血清学诊断、分离培养、免疫细胞化学法和分子生物学方法。血清学诊断主要包括ELISA、血凝抑制试验、中和试验、间接免疫荧光试验等，但这些方法费时费力，不能达到早期诊断的目的。由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，使得鉴别过去、最近还是现在乙型脑炎病毒十分困难。因此，对其抗原表位进行深入细致的研究，鉴别其共同及特异性抗原表位，对于疫苗及诊断试剂的研制都具有重要意义。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金等方法，速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以快速的、高通量的检测大量样品，同时也比较灵敏、可靠，并且已经在不同的病原检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，有其他方法无法代替的优势。

从现有技术中公开的流行性乙型脑炎病毒血清学诊断方面的资料来看，主要存在以下方面的问题：(1)不同黄病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种黄病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。(2)由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的还会超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染流行性乙型脑炎病毒十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与流行性乙型脑炎病毒抗体具有极高亲和力。

本发明的所解决的技术问题在于提供一种流行性乙型脑炎病毒的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立流行性乙型脑炎病毒抗体的胶体金快速检测技术。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测流行性乙型脑炎病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列

优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

该重组抗原蛋白是通过选择乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表答而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。

另一方面，本发明具体实施方式中还提供了一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

一、选择乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。