[发明专利]能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法。

背景技术

人参皂苷是中药人参的主要活性成分，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老和抗癌的药理作用。传统的人参栽培、组织培养和下游的植物组织提取已很难满足市场对人参皂苷的需求。

作为一种三萜类化合物，酵母内源代谢途径可为人参皂苷的合成提供前体2,3-氧化鲨烯。随后的环氧化、氧化以及糖基添加分别由达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶和糖基转移酶完成。达玛烯二醇合成酶基因于2006年被发现。Tansakul等报道PNA(DDBJ数据库，序号AB265170)是催化达玛烯二醇合成的基因。Han等报道了另外一个DDS(DDBJ/EMBL/GenBanK数据库，序号AB122080)。2011年，Jung-Yeon Han等通过对茉莉酸甲酯诱导的人参不定根进行cDNA建库，对转录组测序后经过一系列筛选，确定PPDS基因(cyp716a47)编码原人参二醇合成酶。2014年，GT的筛选也取得一定的进展，周志华等综合已发表的人参转录组的信息，筛选出能将原人参二醇转化为人参皂苷compound K(CK)的糖基转移酶。

基于以上人参皂苷合成途径中相关基因的挖掘，张学礼对酿酒酵母进行工程化，引入DS、PPDS和拟南芥中的AtCPR1，并对酵母甲羟戊酸途径限速过程进行过表达，构建了产原人参二醇的人工酵母细胞。周志华将筛选到的GT基因植入酿酒酵母中，得到了能产CK的酵母细胞。

PPDS是一种细胞色素P450单加氧酶。前期的研究发现，在人工构建的原人参二醇酵母合成途径中，PPDS是一个限速的步骤，单纯的增加PPDS及其还原酶的拷贝并不能解决问题,致使达玛烯二醇的转化效率相对较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。

本发明的第二个目的是提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法。

本发明的第三个目的是提供能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的应用。

本发明的技术方案概述如下：

能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，包括如下步骤：

①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列，所述拟南芥中AtCPR1基因以SEQ ID NO.1所示；

②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端序列连接，构建出PPDS-AtCPR1融合蛋白质的基因元件；

③将PPDS-AtCPR1融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建PPDS-AtCPR1融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。

具体构建过程见实施例3。

上述方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。

上述融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。

所述酿酒酵母内源启动子如PGK1p(磷酸甘油酸激酶1启动子)，序列SEQ ID NO.7。

所述酿酒酵母内源终止子如ADH3t(乙醇脱氢酶3)序列SEQ ID NO.12.

SEQ ID NO.1所示的AtCPR1基因序列为拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶1的基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。

SEQ ID NO.2所示的基因序列为序列SEQ ID NO.1去除前138bp后得到。

SEQ ID NO.3所示的PPDS基因序列为人参中原人参二醇合成酶的基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。

本发明的优点：

实验证明，本发明构建的能提高达玛烯二醇转化效率的PPDS-AtCPR1融合蛋白质在酿酒酵母中比单独存在的PPDS和AtCPR1催化效率高。这种构建方法得到的融合蛋白提高了达玛烯二醇的转化效率，有利于人参皂苷在微生物中的高效合成。

附图说明