[发明专利]一株嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌及其合成琥珀酸的方法

权利要求书

1.一株嗜乙酰乙酸棒杆菌的基因工程菌株，其特征在于，是以乳酸脱氢酶基因ldhA缺失了的嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA为出发菌株，过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，以pXMJ19以表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因。

4.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)PCR反应扩增或化学合成pyc基因片段；(2)将pyc基因片段测序验证后，连接到穿梭表达载体pXMJ19上，获得重组表达质粒pXMJ19-pyc；(3)将重组表达质粒转入乳酸脱氢酶基因缺失菌C.acetoacidophilum△ldhA中，通过氯霉素抗性筛选、验证获得阳性克隆子C.acetoacidophilum△ldhA/pXMJ19-pyc。

5.权利要求1所述基因工程菌在琥珀酸生产中的应用方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分为好氧和缺氧培养两阶段，好氧阶段是在25-37℃、200-800rpm、通气量20-200L/h的条件下培养菌体10-48h；进入缺氧阶段，停止通气，添加适量无机盐和微量元素，添加终浓度为60-120g/L葡萄糖和15-60g/L的碳酸氢钠，25-37℃继续培养30-100h，以生产积累琥珀酸，期间补加碳酸氢钠和葡萄糖，维持pH 6-9。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，从嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA/pXMJ19-pyc甘油管中接取适量菌液至含1％葡萄糖的LB培养基中，25-37℃，100-300r/min条件下培养12-36h；按接种量1％-10％接入3L发酵罐中进行扩大培养，在25-37℃，200-800rpm，通气量20-200L/h的条件下好氧培养10-48h；之后停止空气的通入，添加适量无机盐和微量元素，添加终浓度为60-120g/L葡萄糖和15-60g/L的碳酸氢钠，25-37℃缺氧培养30-100h，期间补加碳酸氢钠和葡萄糖，并维持pH 6-9。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，好氧阶段采用的培养基成分按g/L计含有：葡萄糖10-50，K₂HPO₄0.5-5，MgSO₄·7H₂O 0.5-5，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.06，硫胺素0.00005-0.0005，生物素0.00002-0.0005，尿素0.5-5，玉米浆5-50，pH 7.0-7.2。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，缺氧阶段添加的无机盐和微量元素的终浓度按g/L计为：K₂HPO₄0.5-5，KH₂PO₄0.5-5，MnSO₄·H₂O 0.0001-0.05，FeSO₄·7H₂O0.001-0.06，MgSO₄·7H₂O 0.5-5，硫胺素0.00005-0.0005，生物素0.00002-0.0005。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，缺氧阶段所述补加碳酸氢钠和葡萄糖，是当液体中葡萄糖浓度小于5-10g/L时，补加40-80g/L葡萄糖和10-40g/L碳酸氢钠。