[发明专利]基于基因沉默技术的烟粉虱防御素基因片段及其dsRNA

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和农业生物技术领域。本发明涉及一基于基因沉默技术的烟粉虱防御素(defensin)基因片段及其dsRNA。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨重的损失。烟粉虱共危害对不同的植物表现出不同的危害症状，叶菜类如甘蓝、花椰菜受害叶片萎缩、黄化、枯萎；根菜类如萝卜受害表现为颜色白化、无味、重量减轻；果菜类如番茄受害，果实不均匀成熟。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，是重要的病毒传播媒介，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。但是目前尚不清楚烟粉虱传播病毒的分子机制，对烟粉虱的功能基因研究也相对较少。

RNAi(RNA interference)是由双链RNA引发的转录或转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。长dsRNA被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,与具有序列同源性的mRNA结合并使之降解,从而抑制基因的表达。目前已成功的在果蝇、线虫、锥虫、小鼠和哺乳动物中进行了RNAi研究,，其机制也逐渐被认识。由于RNAi可以特异性地抑制基因的表达,同时可将抑制表达时间控制在发育的特定阶段,产生类似基因敲除的功能,可用来促进新基因功能的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对目前烟粉虱免疫反应研究状况及其不足，提供基于基因沉默技术的烟粉虱防御素(defensin)基因片段及其dsRNA。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种烟粉虱防御素defensin编码基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了烟粉虱防御素defensin编码基因片段的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了含有前述的编码基因的载体。

本发明进一步提供了烟粉虱防御素defensin基因片段的dsRNA的合成方法，是以权利要求3所述载体为模版，以上游引物P1与含T7启动子的下游引物P4、含T7启动子的上游引物P3与下游引物P2分别进行PCR扩增，得到两个具有T7启动子的PCR产物，以此逆转录得到的烟粉虱防御素defensin基因的dsRNA；

所述上游引物P1、下游引物P2、上游引物P3、下游引物P4的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明进一步提供了利用前述dsRNA喂食烟粉虱的方法，具体步骤如下：

(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取新羽化的烟粉虱加入玻璃管内，置于冰盒上，用纱布将玻璃管另一端封好；

(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；

(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间，然后将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上；

(4)利用烟粉虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，并按步骤(3)每24h换一次含dsRNA的饲料。

本发明的有益效果在于：

本发明采用改进的人工饲喂法进行RNAi干扰实验，相对于注射法，减少了虫体的机械损伤，便于操作，且是真正意义上的自然取食，可以广泛地推广。

本发明合成的defensin基因dsRNA能有效沉默defensin基因，其双链结构稳定，能更好的防止RNA酶的降解,为建立利用RNA干扰技术研究烟粉虱基因功能奠定了基础并为控制害虫的新策略提供新的实验手段。

附图说明

图1：烟粉虱dsRNA饲喂装置，图中：加载饲料的膜1、烟粉虱2、玻璃管3。

图2：dsRNA稳定性检测。M：DNA marker；1-4：dsGFP分别在DEPC-处理人工饲料中放置0h,6h,12h,24h；5-8：dsGFP在无菌水中放置0h,6h,12h,24h。

图3：dsRNA对烟粉虱defensin基因转录水平的抑制。“*”表示该系数在0.05显著性水平上是可以接受的，也就是说，该系数的可靠度在95％以上；“**”表示该系数在0.01的显著性水平上可以接受，即它的可靠度在99％以上