[发明专利]一种增强ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ位点的特异性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种增强ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ位点的特异性方法，属于基因检测技术领域。

背景技术

单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）是基因组水平上由单个核苷酸变异引起的ＤＮＡ序列多态性，包括置换、颠倒、缺失和插入，且任一等位基因在人群中的频率不小于１％，随着人类基因组计划的完成和ＳＮＰ数据库ＨＡＰＭＡＰ的绘制，ＳＮＰ检测在临床分子诊断、法医鉴定、新药研发等领域发挥着越来越重要的作用，常见的ＳＮＰ检测方法包括ＤＮＡ芯片杂交、限制性长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）及等位基因特异性ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ，ＡＳ-ＰＣＲ）等，但这些方法均无法同时满足高通量、高准确度和价格低廉的要求。多重连接依赖性探针扩增（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｌｉｇａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｂｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡ）技术由Ｓｃｈｏｕｔｅｎ于２００２年发明，可同时检测４０多条目标序列的拷贝数变化，且改进后的ＭＬＰＡ技术还可同时检测ＲＮＡ、ＳＮＰ位点和甲基化的变化，已在产前、遗传和肿瘤检测等领域得到广泛应用，虽然ＭＬＰＡ反应中的探针连接反应只有当探针和目标序列靶ＤＮＡ完全配对，且两条探针之间没有空隙的条件下才可能发生，但由于碱基之间可能出现错配，而ＳＮＰ序列只有一个碱基的区别，导致ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ时经常由于错配连接而出现假阳性结果，影响结果判读。此类由于碱基错配导致的假阳性问题在ＡＳ-ＰＣＲ中已通过碱基修饰、添加阻滞探针等方法得到改善，但在ＭＬＰＡ中尚未得到解决。

发明内容

本发明的目的是：提供一种增强ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ位点的特异性方法，能快速检测ＳＮＰ位点，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案

一种增强ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ位点的特异性方法，设计针对Ｋｒａｓ基因２１６Ｇ-ＣＳＮＰ位点的ＭＬＰＡ探针，使用ＭＬＰＡ实验，观察其对ＳＮＰ位点检测时的影响。

前述的一种增强ＭＬＰＡ检测ＳＮＰ位点的特异性方法中，直接用锁核酸修饰ＭＬＰＡ探针的ＳＮＰ位点或添加阻滞探针均可显著提高ＳＮＰ检测时的特异性，３个ＬＮＡ修饰的阻滞探针能最好地保证检测的灵敏度和特异性

由于采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明的核心是在ＳＮＰ位点检测特异度时减少探针在ＳＮＰ位点的错配率，可以使用特定化学修饰的核苷酸合成探针，包括ＬＮＡ、肽核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ＰＮＡ）等，这些化学修饰能够显著降低碱基错配率，ＬＮＡ是一种经过修饰的核酸类似物，和普通核酸分子的区别是碳环的２’-ｏｘｙｇｅｎ和４’-ｃａｒｂｏｎ位置上引入了亚甲基桥形成锁状结构，因此称为锁核酸，ＬＮＡ修饰碱基的配对特异性高，结合力强，还可以提高寡核苷酸的解链温度，被广泛用于ＤＮＡ芯片，荧光原位杂交和荧光定量ＰＣＲ中，以提高探针杂交的特异性，本研究发现使用ＬＮＡ修饰ＭＬＰＡ探针的ＳＮＰ位点后，与未加修饰的ＭＬＰＡ探针相比，假阳性产物峰面积明显下降（３２.９ｖｓ１８.４，Ｐ＜００１），Ｃｔ值明显上升（４１.０７ｖｓ３４.１７，Ｐ＜０．０１），说明ＬＮＡ修饰可明显降低碱基错配率，消除假阳性产物峰；但ＬＮＡ修饰探针的检测灵敏度有所下降，表现为检测阳性标本时，与未加修饰的ＭＬＰＡ探针相比，产物峰面积下降（８０.０２ｖｓ９５.００，Ｐ＜０.０１，Ｃｔ值上升（２５.２ｖｓ２４.５３，Ｐ＜０.０１），说明ＬＮＡ修饰可能导致探针杂交或连接效率下降，降低了ＭＬＰＡ检测的灵敏度。

附图说明

附图1为ＭＬＰＡ探针及阻滞探针序列表；

附图2为各实验组探针组成示意图；

附图3为各组检测探针峰面积和Ｃｔ值比较表；

附图4为　ＭＬＰＡ产物毛细电泳结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。

本发明的实施例：

１　材料和方法

１．１　主要试剂和仪器