[发明专利]一种华南半蒴苣苔的离体保存方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及华南半蒴苣苔的离体保存方法。

背景技术

华南半蒴苣苔是苦苣苔科半蒴苣苔属植物，产于广东北部、广西和贵州。生于海拔240-1500米林下阴湿石上或沟边石缝中，生长环境恶劣，华南半蒴苣苔全草可以药用，治咳嗽、肺炎、跌打损伤和骨折等，具有较高的药用价值，但是其存量少，繁殖率低，加上其种子细小，繁殖比较困难，在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难。因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对华南半蒴苣苔资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。

目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。

组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也不尽相同，因此，对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研究也十分必要。

目前对于华南半蒴苣苔离体保存的研究还比较少，授权公告号为CN 103141390B的中国发明专利“红苞半蒴苣苔的繁殖方法”一文中公开了一种人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的方法，为进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，本文只是为保存该物种打下基础，并没有公开如何保存。申请人在公开号为CN 104041412 A的中国发明专利“一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法”中也公开了利用组织培养技术快速繁殖贵州半蒴苣苔的方法，但是同样也并没有公开贵州半蒴苣苔是如何进行保存的，另外申请人还在公开号为CN103651127A的中国发明专利“一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法”一文中公开了对弄岗唇柱苣苔的离体保存时将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d，但是并没有公开此最佳保存培养基的具体配比，而对于离体保存来说，其保存培养基的配比是其保存能否成功的一个重要条件，因此，对其保存培养基的研究和公开具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供一种华南半蒴苣苔的离体保存方法，利用组织培养技术对其进行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，不仅可以有效挽救濒危的华南半蒴苣苔物种，使之成为可再生资源，还可以为华南半蒴苣苔种植提供优良一致种苗的技术和室内离体保存提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种华南半蒴苣苔的离体保存方法，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养：取野外采集的华南半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗2～3次，再次投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗2～3次后切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养10～14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.9，培养温度为24～28℃，光照强度1600～2000lx，光照时间为10～12小时/天；

(2)丛生芽壮苗生根培养：经25～35天，丛生芽长至2～3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4～6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.7，温度为22～25℃，光照强度2600～2800lx，光照时间为10～12小时/天；

(3)试管苗离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.1mg/l+AC0.45％+蔗糖3％+琼脂0.45％；所述培养基的pH值为5.7，温度为18±1℃，光照强度1600～1800lx，光照时间为8～10小时/天。

前述华南半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(1)中所述的接种培养基为：MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖3％+琼脂0.45％。

前述华南半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+IAA0.8mg/l+AC1.0％+蔗糖3％+琼脂0.45％。

本发明的有益效果：

本发明打破了对华南半蒴苣苔离体保存研究的空白，利用本发明的方法可以使种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量华南半蒴苣苔的优质种苗，有效解决了华南半蒴苣苔属种质资源保存及规模化育苗问题。