[发明专利]一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶阳性质控品、阴性质控品，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的的特异性引物及探针，序列分别为：

对虾杆状病毒的

上游引物：BP-F：5’- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3’（SEQ ID NO：1）；

下游引物：BP-R：5’- CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’（SEQ ID NO：2）；

荧光探针：BP-P：5’- TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA -3’（SEQ ID NO：3）；

斑节对虾杆状病毒的

上游引物：MBV-F：5’- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3’（SEQ ID NO：4）；

下游引物：MBV-R：5’- AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’（SEQ ID NO：5）；

荧光探针：MBV-P：5’- CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG -3’（SEQ ID NO：6）；

肝胰腺细小病毒的

上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQ ID NO：7）；

下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQ ID NO：8）；

荧光探针：HPV-P：5’-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’（SEQ ID NO：9）。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有5mM MgCl₂，50mM Tris，100mM KCl， 400mM dNTP，0.1mg/mL GP32蛋白，400nM BP-F、400nM BP-R、400nM MBV-F、400nM MBV-R、400nM BMNV-F、400nM BMNV-R、400nM HPV-F、HPV-R，240nM BP-P、240nM MBV-P、240nM BMNV-P、240nM HPV-P。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述病毒核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，10mM EDTA，1%的 CTAB和1mM的DTT。

4.一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）病毒DNA的提取；

2）多色荧光定量PCR扩增：将多色荧光定量PCR MIX 20μl与热启动Taq酶1μl混合，瞬时离心后，加入提取好待检测的DNA 4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl；放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，设定反应程序为：94℃ 2分钟后；94℃ 15秒，55℃ 30秒，40个循环；若使用带毛细管的仪器LightCycler，则反应程序为：为93℃ 2分钟后；93℃ 5秒 58℃ 45秒，共40个循环；

3）结果分析：根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；

阴性质控品应无扩增曲线，阳性质控品的3种荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线；若待测样品中对虾杆状病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为对虾杆状病毒阳性，若斑节对虾病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为斑节对虾病毒阳性，若肝胰腺细小病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为肝胰腺细小病毒阳性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述病毒DNA提取的具体操作为：将预处理的对虾肝胰腺标本或各期幼体标本先加入10 μL 20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴10分钟后，再加入50μL病毒核酸提取液后，上清液即为待检测DNA样本。