[发明专利]猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中Cap蛋白解离的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中Cap蛋白解离的方法。

背景技术

猪圆环病毒病2型可引起免疫抑制性疾病。该病毒可诱发多种病毒、细菌的混合感染和继发感染，给养猪业造成巨大的经济损失，对此病的研究特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。疫苗作为防控PCV2的主要手段，国内外研究者正在研究和开发各种疫苗，到目前为止，部分疫苗已在临床试验中取得成功，有的已投入应用，其他候选疫苗也正在积极研究中。

但猪圆环病毒2型亚单位疫苗中的Cap蛋白抗原含量决定了疫苗的品质，因此直接检测疫苗中Cap抗原含量是疫苗效力检验最常用、最直接的方法之一，但由于猪圆环病毒2型亚单位疫苗中加入了铝胶佐剂，琼扩试验中直接影响抗原检测的结果。因此，有必要提供一种铝胶佐剂疫苗中Cap蛋白解离的方法，从而更好的评价疫苗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、高效的可用于铝胶疫苗中Cap蛋白解离的方法，从而为猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗的成品疫苗效力检验(蛋白的琼扩效价检测)奠定了坚实的基础。

本发明首先提供一种解离剂，该解离剂为寡聚核苷酸，其核苷酸序列如下：

5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′(SEQ ID NO:1)，每个核苷酸碱基进行硫代化修饰；

上述的解离剂用于将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来；

本发明还提供一种将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来的方法，是在疫苗中加入解离剂，在震荡条件下37℃处理1小时或以上。

本发明采用琼扩试验来评价上述方法的解离效果。

本发明提供的解离剂能够有效的将猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中的Cap蛋白抗原解离出来，从而能更准确有效价评价疫苗的效果，为铝胶佐剂疫苗的效检提供了一种很好的方法。采用本发明的工艺操作简单，对设备要求低，而且样品处理量大。

具体实施方式

将不同琼扩效价的抗原制备的铝胶佐剂疫苗，通过加入解离剂，揺匀后放入揺床37℃，200转/分钟，作用1小时，取解离前和解离后的上清进行琼扩试验，通过研究发现，解离前琼扩效价均为阴性，解离后琼扩效价与配苗前的琼扩效价有很好的相关性，解离后抗原琼扩效价比配苗前效价低0～1个滴度。本发明能更好的评价疫苗中的有效的蛋白含量，能更准确的评价疫苗的效果。

本发明所使用的解离剂，是寡聚核苷酸，其序列：5’-T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T-3’(*表示对每个碱基进行硫代化),分子量为7696.8，退火温度为57.3℃。该解离剂可以人工合成，本发明实施例中的解离剂由大连宝生物工程有限公司合成。

下面结合实施例对本发明进行具体说明。

实施例1

1 不同抗原效价疫苗的制备 取灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白液(AGP效价为1:64)做为制苗抗原，用灭菌生理盐水分别将其稀释成AGP效价为1:16、1:8、1:4、1:2和1:1后，按4份抗原液加1份铝胶佐剂的比例制成PCV2灭活疫苗。

2 疫苗解离 将上述制备的5种疫苗，分别取摇匀的疫苗5ml，加入0.25g解离剂后，放入设定200r/min的揺床，37℃解离1小时，以5000r/min离心10分钟取上清准备进行琼扩试验和免疫组化试验。

3 Cap蛋白琼扩效价测定

3.1 pH值7.2，0.01mol/L PBS溶液的配制精密称取NaH2PO4·2H2O 1.56g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，NaCl 9.0g，加蒸馏水400ml充分溶解后，然后加蒸馏水至1000ml，调pH值至7.2。

3.2 琼脂平板的制备 pH值7.2，0.01mol/L PBS 100ml，加1.0g琼脂糖，用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。取无菌直径90mm平皿，加入溶解后的琼脂20ml，制成约3mm厚的琼脂平板，待琼脂完全凝固后，平皿加盖并倒置，2～8℃冷藏备用。

3.3 测样 用直径4mm，中央孔与外周孔距为4mm的梅花形打孔器打孔，封底。中央孔加入标准阳性血清，外围孔依次加入倍比稀释的待检Cap蛋白抗原，加液量以不溢出加样孔为宜，加样完毕后，静置5～10分钟，将平皿轻轻倒置，放入湿盒内置37℃温箱中作用24～48小时，观察结果。以出现Cap蛋白抗原最高稀释倍数为待检样品的琼扩效价。