[发明专利]用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法

说明书

为了在pH受控的分批发酵中在矿物盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸，构建了经遗传改造的微生物，但不添加质粒或外源基因。本发明还提供了生产琥珀酸和苹果酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物。

本申请为2008年3月19日提交的，发明名称为“用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法”的PCT申请PCT/US2008/057439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2009年9月18日，申请号为200880008975.1。

与相关申请交叉参考

本申请主张2007年3月20日提交的美国临时申请系列号No.60/895,806的权益，其公开内容通过整体引用作为参考，包括所有的图、表格和氨基酸或核酸序列。

政府支持

根据授权号USDOE-DE FG02-96ER20222下由能源部(Department of Energy)授权的，和授权号USDA&DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019下由能源部与美国农业部(United States Department of Agriculture)联合授权的政府支持，完成了本发明。政府对本发明具有某些权利。

发明背景

随着石油价格的提高，从可更新的原料发酵生产琥珀酸会越来越有竞争力。琥珀酸可作为底物用于转化成塑料、溶剂和目前由石油制成的其他化学品(Lee等，2004；Lee等，2005；McKinlay等，2007；Wendisch等，2006；Zeikus等，1999)。许多细菌被描述为具有生产琥珀酸作为主要发酵产物的天然能力(美国专利号No.5,723,322；表1)。然而，通常需要复杂的工艺、复杂的培养基和长久的孵育时间。

先前已使用多种遗传手段改造大肠杆菌菌株(Escherichia coli)用于生产琥珀酸，并取得了不同程度的成功(表1)。在大部分研究中，达到的滴度较低，并且需要复杂的培养基成分例如酵母提取物或玉米浆。菌株NZN111以每摩尔被代谢的葡萄糖0.98摩尔琥珀酸的摩尔产率生产108mM琥珀酸(Chatterjee等，2001；Millard等，1996；Stols和Donnelly，1997)。该菌株如下改造得到：使两个基因失活(编码丙酮酸-甲酸裂解酶的pflB和编码乳酸脱氢酶的ldhA)并过表达来自多拷贝质粒的两个大肠杆菌基因：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)和苹果酸脱氢酶(mdh)。菌株HL27659k如下改造得到：突变琥珀酸脱氢酶(sdhAB)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ackA)、丙酮酸氧化酶(poxB)、葡萄糖转运蛋白(ptsG)和异柠檬酸裂合酶阻抑物(iclR)。该菌株生产少于100mM的琥珀酸并需要氧受限制的发酵条件(Cox等，2006；Lin等，2005a，2005b，2005c；Yun等，2005)。使用在计算机芯片上的代谢分析设计基因敲除，从而在大肠杆菌中创建与Mannheimia succiniciproducens中的天然琥珀酸途径相似的途径(Lee等，2005和2006)。然而得到的菌株生产非常少的琥珀酸。Andersson等，(2007)报道了仅含有天然基因的经改造的大肠杆菌琥珀酸生产的最高水平(339mM)。

其他研究人员从事的是在大肠杆菌中表达异源基因的备选途径。从多拷贝质粒中过表达Rhizobium eteloti丙酮酸羧化酶(pyc)，从而指导碳流向琥珀酸(Gokarn等，2000；Vemuri等，2002a，2002b)。如下构建菌株SBS550MG：使异柠檬酸裂合酶阻抑物(iclR)、adhE、ldhA和ackA失活，并从多拷贝质粒中过表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的citZ(柠檬酸合酶)和R.etli pyc(Sanchez等，2005a)。使用该菌株，以1.6的摩尔产率从葡萄糖生产160mM琥珀酸。