[发明专利]一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。

背景技术

掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)早是在1931年由Drechsler从马铃薯块茎上分离得到。掘氏疫霉在我国是1982年报道的，可以侵染黄瓜的一个新种。目前掘氏疫霉侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的土传毁灭性病害，危害寄主广泛，常给多种经济作物(如黄瓜、甜菜、马铃薯、雪松等)的生产带来严重损失。掘氏疫霉菌属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。掘氏疫霉菌引起的植物病害分布广泛，所以建立掘氏疫霉菌的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。

传统的掘氏疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在掘氏疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测掘氏疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，掘氏疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中掘氏疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述掘氏疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明另一目的是提供上述掘氏疫霉菌的LAMP检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

FIP：5′-CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAA-AATGAAGAGTCGACTCTAGCA-3′；

BIP：5′-ACTATTGAGCTGGACGGCAA-TCGATAGCAGCCCAAGAG-3′；

F3：5′-GTGATCCTTTCACCCTGG-3′；

B3：5′-TTACAAATGTCAGCTGGATG-3′；

LB：5′-TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT-3′。

所述的LAMP检测引物组合物在检测掘氏疫霉菌中的应用。