[发明专利]一种织纹螺科线粒体COI基因的扩增引物、方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种织纹螺科线粒体COI [细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit I）]基因的扩增引物，利用该引物扩增织纹螺科线粒体COI 基因的方法。

 

背景技术

织纹螺科（Nassarius）隶属于腹足纲（Gastropoda），前鳃亚纲(Prosobranchia)，新腹足目（Neogastropoda），在世界各地海域均有分布，其种类繁多，在维持海洋潮间带生态平衡具有重要作用，部分物种还可以作为检测海洋有毒污染物tributyltin (TBT) 的指示工具。其中大部分织纹螺物种肉食鲜美，广受中国消费者的喜爱，具有重要的经济价值。然而近几年来，由于食用织纹螺而中毒的事件屡有报道，全国沿海已有多例食用织纹螺而中毒死亡的事件。因此织纹螺物种存在着严重的食品安全问题。导致织纹螺有毒的原因目前还尚不清楚，可能与其从海水中获取的食物有关。相关研究指出织纹螺的毒性与种类相关，比如，一些织纹螺有毒性，一些织纹螺无毒，而某些织纹螺的毒性随着季节的变化而改变。因此，正确的物种鉴定是研究织纹螺毒性的基础。然而由于外部环境因素的影响，织纹螺同一种内和不同种间的贝壳外部形态具有高度的可变性，齿舌结构也极具复杂性，使得利用形态特征对织纹螺进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些亲缘物种，单利用形态特征很难区分开来。

    近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法，其中线粒体COI基因成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因，并对许多物种得到了成功的应用。因此，利用COI基因对织纹螺科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。

    然而织纹螺科物种COI序列变异度较高，不同物种的序列差异较大，使得COI通用引物的扩增效率低下，有些物种根本无法扩出，以致阻碍了分子技术的使用。

发明内容

针对纹螺科物种COI序列变异度较高，COI通用引物扩增效率低下的问题，本发明通过大量的试验，获得一对织纹螺科线粒体COI基因的扩增引物，同时，以该扩增引物为基础，提供织纹螺科线粒体COI基因的扩增方法和纹螺科物种的检测方法。

本发明的目的具体通过以下技术手段获得：

    1.本发明提供一种织纹螺科线粒体COI基因的扩增引物，其序列是ZLCO1490F：5’-TTTCT ACAAATCATAAAGACATTGG-3’和ZHCO2198R：5’-TATACCTCCGG GTGACCAAAAAATCA-3’。

    2.本发明还提供一种织纹螺科线粒体COI基因的扩增方法，其以上述1提供的扩增引物扩增待检测织纹螺科物种DNA,获得680bp的扩增DNA片段，即为所获得的该织纹螺科物种线粒体COI基因。

    3.上述2提供的扩增方法，其中，扩增反应过程为：10μL PCR反应体系为：1μL10×buffer Mg²⁺，1μL DNTP (2mM)，0.6μL Mgcl₂(25mM)，1μL 引物MLCO1490F (10μM), 1μL 引物 MHCO2198R（10μM），0.08μL r-Taq （5u/μL），1μL DNA模板，4.32μL双蒸水，PCR热循环的退火温度为49^oC。

本发明提供的织纹螺科线粒体COI基因的扩增引物通过以下方案获得：a、用COI通用扩增引物扩增出部分织纹螺科物种的COI序列；b、将所述的COI通用扩增引物序列与已获得的部分织纹螺科物种的COI序列进行比对，找出织纹螺科线粒体COI序列在COI通用扩增引物序列段的所有突变碱基，重新合成不同的织纹螺科COI扩增引物；c、从新合成的不同COI扩增引物中筛选出扩增织纹螺科物种效果最好的一对引物。

有益效果：

1.本发明根据织纹螺科物种COI序列变异度极高和COI通用扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出织纹螺科COI基因的扩增引物。采用本发明的织纹螺科线粒体COI基因的扩增引物，可以有效的扩增出织纹螺科不同物种的COI序列，大大提高了扩增效率和正确性。