[发明专利]一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，包括以下步骤：

（1）NASBA扩增： 将纯化好的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系中，体系包括0.5-1μM正向引物和0.5-1μM反向引物；

反应步骤：65℃ 变性后降温，然后加入NASBA酶反应液进行等温扩增反应，条件为： 41℃90分钟，得到RNA扩增产物；

其中：NASBA反应缓冲液体系包括NASBA反应缓冲液、NASBA正向引物和反向引物；

 NASBA反应缓冲液，包括：30-60mM Tris-HCl(PH8.0); 60-80mM KCl；10-30mM MgCl2；0.5-2mM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）; 0.5-2mM 核糖核苷三磷酸（NTPs）；5-20mM 二硫苏糖醇；5-20%（v/v） 二甲基亚砜（DMSO）；

NASBA正向引物和反向引物，包括，0.5-1μM正向引物（E2P7f）： ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT；0.5-1μM反向引物（E2P7T7r）：GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAAC ACTACCTCACCC T；

NASBA酶反应液，包括：T7RNA聚合酶40-80U；AMV逆转录酶2-10U；RNA酶（RNAseH） 0.05-0.15U，0.5-5μg的牛血清白蛋白（BSA） ；

（2）G-四链体荧光检测反应：取G-四链体荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括上游探针0.5-2μM和下游探针0.5-2μM，加无菌双蒸水补足为96μl，加入2μl的RNA扩增产物；然后85℃变性3 min后降温；加入原卟啉0.5-2μM，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪，以399nm波长的光源激发，检测610nm波长处发射的荧光；检测到的荧光强度高于3.0×107U即可判断为猪瘟病毒阳性国；

其中：G-四链体反应缓冲液的组成包括：10mM 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 200mM的氯化钠和20mM的氯化钾；上游探针0.5-2μM和下游探针0.5-2μM。

2.如权利要求1所述的一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，其中：G-四链体反应缓冲液中的上、下游探针包含4段GGG序列，该序列又被拆分为两个部分：一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。

3.如权利要求1或2所述的一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，其中：G-四链体反应缓冲液中的探针包括，上游探针（E2- -A）：GCTGATAGTGACCTACATTGGGTTGGGTTGGG；下游探针（E2--B）：TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC。

4.一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测用试剂盒，其组成为：

（1） NASBA反应缓冲液包括：30-60mM Tris-HCl(PH8.0); 60-80mM KCl；10-30mM MgCl2；0.5-2mM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）; 0.5-2mM 核糖核苷三磷酸（NTPs）；5-20mM 二硫苏糖醇；5-20%（v/v） 二甲基亚砜（DMSO）；

（2）NASBA正向引物和反向引物包括，0.5-1μM正向引物（E2P7f）： ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT；0.5-1μM反向引物（E2P7T7r）：GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAAC ACTACCTCACCC T；

（3）NASBA酶反应液包括：T7RNA聚合酶40-80U；AMV逆转录酶2-10U；RNA酶（RNAseH） 0.05-0.15U，0.5-5μg的牛血清白蛋白（BSA） ；

（4）G-四链体反应缓冲液中的上、下游探针包含4段GGG序列，该序列又被拆分为两个部分：一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1；

（5）G-四链体反应缓冲液中的探针包括，上游探针（E2--A）：GCTGATAGTGACCTACATTGGGTTGGGTTGGG；下游探针（E2--B）：TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC；

（6）G-四链体反应缓冲液的组成包括：10mM 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 200mM的氯化钠和20mM的氯化钾；上游探针0.5-2μM和下游探针0.5-2μM。