[发明专利]一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪伪狂犬病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR（探针法实时-定量聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种可感染多种家畜和野生动物的疱疹病毒，猪是该病毒贮存宿主和传染源，该病毒可引起母猪繁殖障碍及初生仔猪大批死亡；成年猪则出现隐性感染，长期带毒排毒，严重影响种猪场生产及优良品种的推广，给养猪业造成极大的损失。国内对猪伪狂犬病的诊断方法主要包括病毒分离鉴定和血清学诊断方法等，病毒分离鉴定由于费时费力而不适于临床检测；由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断。常规的PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，一方面耗时较长，不但不适于大批量样本的快速检测，而且容易因操作污染导致假阳性结果；另一方面因核酸电泳时溴化乙锭染色剂的使用对工作人员及环境造成一定的危害。与病毒分离、免疫荧光等传统方法相比，实时定量PCR方法更加省时，且操作简单，还可以利用标准曲线计算待检样品拷贝数。另外，核酸探针具有特定的序列，只能与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段进行结合，也就只能用于样品中特定基因片段的检测，因此更加特异。该技术具有敏感性高，特异性强，用时短等优点，而且可以通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，已成为病原体检测的重要方法。

本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求。其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点均优于普通PCR方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确及定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测病毒的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。

所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：

SEQ ID NO:1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA， 

SEQ ID NO:2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。

所述探针引物序列为：

SEQ ID NO:3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。

所述扩增引物扩增出的条带序列为：

SEQ ID NO:4（123 bp）：

ccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgcgtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccggcggcgctacaaca。

所述阴性对照为无DNA/RNA酶水。

所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒基因序列的阳性质粒pGM-123以及制作的标准曲线；其构建方式如下：

a. PRV基因组DNA的提取按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit（凯杰公司脱氧核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作。以提取PRV灭活疫苗基因组DNA为模板；以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性2min；94℃变性50s, 60℃退火50s, 72℃延伸50s, 共30个循环；72℃再延伸10min, 4℃ 5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

b. PCR产物的克隆及序列分析：

PCR产物用AXYGEN（爱思进）公司的胶回收试剂盒回收，与pGMD-T-Easy克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用AXYGEN质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pGM-123。