[发明专利]一种鸡传染性脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法

权利要求书

1.一种用于检测禽传染性脑脊髓炎病毒的荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有如下的组分：

1)一抗：用于检测禽脑脊髓炎病毒的鸡单因子血清抗体；

2)二抗：FITC标记的兔抗鸡IgG；

3)阳性对照样品：AEV Van Roekel株；

4)固定液：按丙酮与无水醇体积比3：2配制的固定液；

5)PBS洗液：按Nacl 8.0g；Kcl 0.2g；Na₂HPO₄ 3.58g；KH₂PO₄ 0.24g定容至1L配制，调至PH7.2。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的鸡单因子血清抗体的制备方法如下：将禽脑脊髓炎活疫苗弱毒株按每羽份病毒滴度≥10^4.0EID₅₀口服免疫3～4周龄的雏鸡，免疫28天后用禽脑脊髓炎强毒株进行脑内接种攻毒，采集攻毒后21天的无禽脑脊髓炎症状的雏鸡血清，制备出用于检测禽脑脊髓炎病毒的鸡单因子血清抗体。

3.权利要求1所述的试剂盒在检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量中的应用。

4.一种检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量的方法，其特征在于，所述的方法如下：

将禽脑脊髓炎活疫进行连续10倍梯度稀释，梯度为10^-2～10^-6，每个梯度接种24孔细胞培养板的4个孔中，每孔取100μl稀释的疫苗液接种于长成70％～80％的单层CEN细胞，剩余4个培养孔作为阴性对照，连续培养72小时后，利用构建的检测AEV的荧光免疫检测试剂盒进行IFA，计算显微镜下视野中出现特异性绿色荧光的阳性细胞的个数，此梯度视野中至少有5个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。按照疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均阳性细胞数/区域)×(稀释比例)/(0.1ml)的公式计算疫苗中病毒含量。

5.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的鸡胚脑神经胶质细胞的制备方法如下：将12日龄SPF鸡胚的大脑组用PBS洗涤后，用0.25％的胰酶溶液消化15min，1000r/min离心5min，沉淀用M199培养液洗涤1次，然后用胰酶继续处理5min，直到细胞完全消化开。然后用1000r/min离心10min收集细胞，并用M199生长液重悬，然后进行培养并连续1～2次传代完成制备。

6.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的M199生长液的组成如下：10％胎牛血清，2％NaHCO₃，青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。