[发明专利]一种利用重组钝齿棒杆菌生产黑色素的方法

权利要求书

1.一种重组表达载体pXMJ19-melC1C2的构建，其特征是：

利用PCR扩增技术中得到来源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶基因(melC1C2)的完整表达基因片段，与克隆载体pMD-18T相连，获得该基因的大量克隆，经双酶切，片段纯化后与表达pXMJ19连接，再转化到大肠杆菌JM109中得到稳定的重组质粒pXMJ19-melC1C2。

2.一种重组钝齿棒杆菌，其特征是：

将权利要求1中构建的重组载体pXMJ19-melC1C2，利用电击转化法转化到钝齿棒杆菌SYPA5-5，酪氨酸酶基因(melC1C2)在重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2中成功表达。

3.将权利要求2所述的重组钝齿棒杆菌产酪氨酸酶的方法，其特征是：

将该菌株以2％接种量接种于50mL LBG培养基中，培养3～4h后，加入IPTG诱导12h后离心收集菌体，用PBS(pH7.0)缓冲液洗涤两次，最后用5ml的PBS(pH7.0)缓冲液悬浮，超声波破碎细胞，酪氨酸酶酶活约为61.5U/mL，而原始菌株C.crenatum SYPA5-5没有酶活。

4.将权利要求3所述重组钝齿棒杆菌发酵产的酪氨酸酶，进行全细胞转化成黑色素，其特征是：将权利要求3发酵产酪氨酸酶，PBS(pH7.0)缓冲液收集，洗涤，悬浮菌体后，分别以1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL的L-酪氨酸为底物，并加入15uM CuSO4催化反应，最后用pH6.2PBS缓冲液把转化反应混合液的总体积补齐到100mL。