[发明专利]清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法

权利要求书

1.清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：

⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板；

⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；其中

所述正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；

所述反向特异性引物序列如下所示：

猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；

羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；

鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；

老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；

牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp；

⑶将所述通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物；

⑷提取待测肉品DNA：

将待测肉品10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板；

⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：

2×Taq PCR StarMix     15uL

多重PCR引物         6.7uL

对照肉品DNA模板    2.0uL

灭菌蒸馏水补足至30uL；

⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：

2×Taq PCR StarMix    15uL

多重PCR引物        6.7uL

待测肉品DNA模板    2.0uL

灭菌蒸馏水补足至30uL；

⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物；

⑻分别将10uL所述对照肉品DNA的PCR产物、所述待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当所述待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的一个泳道上出现片段大小为138bp、199bp、327bp、378bp、499bp五个条带中的一个或多个时，即判定该待测肉品含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。