[发明专利]一种提纯鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提纯鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

近年来，将含有特异性ＩｇＹ的免疫鸡蛋口服用于防治轮状病毒腹泻、脊髓灰质炎、甲型肝炎和其它肠道感染性疾病并取得满意效果，亦有口服特异性ＩｇＹ鸡蛋产品替代抗生素成功治疗胃肠道疾病的报道，鸡卵黄抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｏｆｅｇｇｙｏｌｋ，ＩｇＹ）是由母鸡血液中ＩｇＧ转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，免疫鸡蛋黄中含有大量来源于血清的ＩｇＧ抗体（即ＩｇＹ），浓度远高于血清，维持时间长达２８周，具有高度稳定性和生物学活性，这使鸡卵黄抗体ＩｇＹ口服防病治病成为可能，目前国内外已有较多关于怎样从鸡蛋黄中提取ＩｇＹ的报道，但存在诸如实验步骤繁琐不易操作、ＩｇＹ提取的纯度与得率均较低等缺点。

发明内容

本发明的目的是：提供一种提纯鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ方法，该方法能准确分析株革兰阴性杆菌的分布和耐药性制备ｌｇＹ具有纯度高、得率高、特异性强及利用小体积样品获得大量纯化蛋白的优点，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案

一种提纯鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ方法，该方法采用pＨ５.１水稀释法加盐析法,即两步硫酸铵法对提纯鸡卵黄除脂，以获得较高纯度的ＩｇＹ。

前述的一种提纯鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ方法中，所述两步硫酸法为将蛋黄液加入双蒸馏水后使得pH值为5.1，通过离心并用滤纸过滤除脂后得到上清液，上清液加入硫酸铵晶体，采用离心方法获得白色沉淀，将白色沉淀放入pH7.4PBS中，再加入硫酸铵晶体，再次加入硫酸铵晶体，然后离心获得白色沉淀并融入pH7.4的PBS中，置于双蒸水中搅拌透析得到样品。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的两步硫酸铵法提纯的ＩｇＹ纯度与得率均高于饱和硫酸铵法，用ＢａｎｄＳｃａｎ软件分析蛋白纯度，前者所得的ＩｇＹ纯度可达９０％以上，而后者所得的ＩｇＹ纯度约为７２％,用Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法测定ＩｇＹ蛋白浓度，前者蛋白得率为６.２５ｇ／Ｌ蛋黄，后者蛋白得率仅为４.２５ｇ／Ｌ蛋黄。显然两步硫酸铵法提取的ＩｇＹ纯度与得率均高于后者。

具体实施方式

下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。

本发明的实施例：

１　材料与方法

１．１　动物与试剂

罗曼母鸡由重庆医科大学动物中心提供；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ凝胶配制试剂盒Ｐ００１２Ａ、蛋白分子量标准Ｐ００６１、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ蛋白上样缓冲液（５Ｘ）、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳液Ｐ００１４Ｂ、考马斯亮蓝染色液（常规法）Ｐ００１７Ｂ、考马斯亮蓝脱色液（常规法）Ｐ００１７Ｃ、ＰＢＳ、硫酸铵、ＥＤＴＡ均由碧云天生物技术研究所提供。

１.２   ＩｇＹ提取与纯化

１.２.１　两步硫酸铵提取方法

取消毒完毕的鸡蛋１个，用剪刀打开一个小洞，让蛋清缓缓流出至不能再流出后，再以无菌生理盐水洗净卵清，将整个卵黄小心移至滤纸上，来回滚动，除尽蛋清,再用针头刺破蛋黄，使之移到量筒。量取约８ｍｌ蛋黄液，加１０倍双蒸水稀释卵黄，混匀后调ｐＨ值为

５.１，－２０℃过夜，室温解冻，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心３０ｍｉｎ，再将上清液用滤纸过滤除脂，获得较清上清液,上清液加入硫酸铵晶体，使其浓度为１９％，静置１ｈ后，再次以１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ，取其白色沉淀,将白色沉淀溶于１５ｍｌ０.０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７-４ＰＢＳ中，再加入硫酸铵晶体，使其浓度为１４％，再次静置１ｈ后，再次以１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ，取其白色沉淀，溶于０-０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７.４的ＰＢＳ２ｍｌ中,置于双蒸水中搅拌透析，１ｈ后更换透析液一次，共４～５次，透析过夜后，析出透析后的样品，再以０.２２μｍ滤器过滤灭菌,获得ＩｇＹ后用无菌ＥＰ管盛装，置－２０℃保存。

１.２.２　透析袋处理

在３００ｍｌ透析处理液（２％ＮａＨＣＯ_３、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中将透析袋煮沸１０ｍｉｎ后，以蒸馏水彻底漂洗后再在３００ｍｌ（ｐＨ８）１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ液中煮沸１０ｍｉｎ，再以灭菌水里外彻底冲洗。

１.２.３　饱和硫酸铵提取方法