[发明专利]一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法

权利要求书

1.一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法，从肝素出发，制备得到肝素衍生物N-脱硫酸肝素，N-脱硫酸肝素的氨基与叶酸通过交联剂EDC在非均相或均相反应中通过酰胺键连接形成肝素叶酸缀合物，通过透析除去未反应的游离叶酸和EDC并将透析后产物冻干得到固体，通过紫外光谱扫描和红外光谱扫描表征缀合物的结构，并检测缀合物的生物活性，确定制备得到的缀合物为具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：精密称取500mg肝素钠完全溶解于3mL去离子水中，加入50mL无水DMSO后，搅拌条件下55℃恒温水浴2h后加入同体积去离子水结束反应，反应结束后用1M NaOH调pH至8～9，用冷的无水乙酸钠饱和的无水乙醇沉淀肝素衍生物，4℃沉淀过夜，离心收集沉淀，冰无水乙酸钠饱和的无水乙醇洗涤沉淀两次，适量去离子水溶解沉淀，使用截留分子量为3500的透析膜在去离子水中透析3d，然后冻干得白色絮状固体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：精密称取40mg叶酸放入锥形瓶中，加入10mL DMSO，搅拌下加入20μL EDC，搅拌条件下25℃恒温水浴1h，反应在避光条件下进行，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：精密称取100mg N-脱硫酸肝素，均相反应，即悬浮于10mL DMSO中，磁力搅拌下将叶酸活性酯的DMSO溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，搅拌条件下30℃恒温水浴16h，反应在避光条件下进行；精密称取100mg N-脱硫酸肝素，非均相反应，即完全溶解于10mL pH为4.7(或pH为5.6)的醋酸-醋酸钠缓冲液中，将叶酸活性酯溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，边滴加边搅拌，搅拌条件下30℃恒温水浴16h，反应在避光条件下进行。

5.根据权利要求1和4所述的方法，其特征在于：非均相反应，pH4.7为最佳反应条件，得肝素叶酸缀合物最佳偶联比为3.01。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应结束后用截留分子量为3500的透析膜在蒸馏水中透析1d，除去DMSO，取出淡黄色微浊液体，高速离心30min除去不溶于水的叶酸分子，继续用蒸馏水透析4d，取出透析袋中淡黄色透明液体冻干得淡黄色絮状固体产物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：肝素叶酸缀合物抗凝血活性为未修饰肝素抗凝血活性的10.6％，对肿瘤细胞具有靶向识别能力和一定的抗肿瘤活性。