[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程和遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法。

背景技术

自上世纪80年代基因工程兴起以来，大量基因编辑技术出现以满足科研需要，其中的基因打靶技术是一种在高等动物中对基因进行定点精细修饰的技术。传统基因打靶技术依赖体内自发的同源重组(HR,homologous recombination)，效率大约只有1/10⁶。近年来为了解决同源重组效率低下的问题，人们通过人工构建的杂合分子对特定的DNA序列进行切割，以此来提高基因打靶的效率，其中以核酸内切酶为核心的人工复合分子最受关注。

Myostatin基因(GDF8)是转移生长因子超家族的成员，它在动物体内作为肌肉生长的负调节因子，在肌肉的形成及分化发育过程中发挥重要作用。自然界中天然存在myostatin基因的自然突变型动物，如比利时蓝牛、皮尔蒙特牛等，它们都具有肌肉极端发达的表型，因此在生产领域具有极为重要的实用价值。而通过传统的基因工程技术对哺乳动物，尤其是大动物进行myostatin基因进行敲除存在很大的技术难度，因而一直以来大动物的myostatin基因敲除效率非常低下。

CRISPR/Cas9系统包括一个具备DNA结合和切割的Cas9蛋白以及负责特异性识别DNA序列并引导Cas9蛋白特异性结合到目的DNA位点的sgRNA。在动物体内，Cas9蛋白与sgRNA首先结合成一个蛋白复合体，然后通过sgRNA的特异性识别作用，在基因组中识别到特定的目标DNA序列并一到蛋白复合体结合到DNA链上。然后通过Cas9的核酸内切酶活性在目标位点将DNA切开，形成一个DNA双链断裂(DSB)。通过诱导自体的DNA修复机制发挥作用，如同源重组或非同源末端连接(NHEJ，Non-homologous end joining)，从而在该位点产生基因突变，从而到达基因打靶的目的。

与传统的同源重组介导的基因打靶相比较，利用CRISPR/Cas9系统对哺乳动物进行基因打靶具有操作简便，效率高，适用物种广泛等优点，尤其可以一次性的实现多基因打靶，这在动物遗传修饰及疾病模型研究中都有极其广阔的应用前景。

传统的基因打靶技术依赖生物体内自发的同源重组现象，因而效率很低，随着技术发展后来便出现了锌指核酸酶(ZFNs，zinc finger nucleases)和转录激活子样效应子介导核酸酶(TALENs，transcription activator-like effector nucleases)。这两种系统结构比较相似，每个蛋白分子都是由FolkI核酸内切酶结构域和DNA识别结构域两部分构成，通过每个蛋白分子中的特异性DNA识别域识别基因组中的特定目的序列，从而将FolkI内切酶定位至靶位点。由于FolkI核酸内切酶需要在DNA双链上形成二聚体形式才能发挥核酸内切酶的功能，因而ZFNs和TALENs在基因打靶时都需要两个分子分别定位在靶位点的两条DNA链上，才可以发挥核酸内切酶的作用，对DNA进行切割产生双链断裂(DSB).

虽然ZFNs和TALENs相比于传统的同源重组具有打靶效率高的优点，但是它们依然存在很多的缺陷，主要包括：1、ZFNs和TALENs的DNA切割结构域均为FolkI，它必须以二聚体形式发挥作用，因而对哺乳动物进行基因打靶时至少要采用两个DNA表达结构，这在细胞转染时会对转染效率有更高的要求；2、ZFNs的设计和生产相对复杂，成本较高，应用于大量的哺乳动物基因打靶时成本难以控制在可以承受的范围；3、ZFNs和TALENs的DNA识别规则和设计要求较为严格，可能出现靶基因序列中无法找到合适的ZFNs、TALENs识别区，从而无法应用其进行基因打靶的情况；4、针对不同基因或者不同物种的同一基因进行基因打靶时，都需要从新设计和构建新的ZFNs、TALENs表达质粒或mRNA，操作繁复；5、ZFNs和TALENs在进行多基因打靶时，受载体和mRNA分子大小的限制，很难获得较高的打靶效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法。

本发明的另一个目的是提供特异性靶向myostatin基因的sgRNA。