[发明专利]一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法

权利要求书

1.一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，包括休眠孢子悬浮液的收集和芸薹根肿菌的遗传转化，其具体步骤如下：

（a）制备根分泌液：将催芽2-3d的幼苗播种在Hoagland营养液中，24℃/18℃光暗交替培养，7d后将收集到的根分泌液用0.22um细菌过滤器过滤，即获得根分泌液；

（b）收集休眠孢子液：将芸薹根肿病根切碎后搅成匀浆，以8层纱布过滤后，滤液以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入质量分数为50%的蔗糖溶液，500rpm离心5min，取上清液和上层灰色层；将上清液和上层灰色层以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入ddH₂O重悬，6000rpm离心10min，取沉淀，重复加入ddH₂O离心三次，向第三次获得的沉淀中加入ddH₂O，再加入硫酸粘杆菌素和盐酸万古霉素至终浓度均为1ug/ml，24℃黑暗培养24h后，再以6000rpm离心10min，取沉淀用ddH₂O洗涤三次后，向沉淀中加入步骤a获得的根分泌液重悬至孢子浓度为5×10⁸个/ml，即获得休眠孢子液；

（c）制备感受态休眠孢子液：将步骤b获得的休眠孢子液于24℃以60rpm震荡培养6h，6000rpm离心5min，取沉淀悬浮于0.1M TE/LiAc溶液，37℃，60rpm震荡培养30min，获得感受态休眠孢子液；

（d）芸薹根肿菌遗传转化：将带有绿色荧光蛋白eGFP的质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA加到步骤c获得的感受态休眠孢子液中，冰浴1h后，加入PTC缓冲液，24℃黑暗培养1h，再加终浓度为300ug/ml的博莱霉素，24℃黑暗培养3h，然后2000rpm离心5min；取沉淀，向沉淀中加入STC缓冲液重悬，然后2000rpm离心5min，重复离心两次，取第二次离心获得的沉淀，加入ddH₂O调整孢子浓度至5×10⁸个/ml，即获得遗传转化孢子液；

（e）博莱霉素抗性筛选：将步骤d获得的遗传转化孢子液接种寄主，60d后收集病根休眠孢子液，经300ug/ml的博莱霉素24℃培养24h后，用ddH₂O洗3次，调节孢子浓度5×10⁸个/ml，再次接种寄主，重复接种筛选三代后，所获得的休眠孢子液中的孢子即为稳定遗传转化孢子。

2.根据权利要求1所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c中所述质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA的加入量均为每200ul感受态休眠孢子液中加入10ug。

3.根据权利要求2所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤b所述0.1M TE/LiAc溶液的配制方法为：10×TE缓冲液10ml，1M LiAc 10ml，加ddH₂O至100ml，调节pH=7.5，再用0.22um细菌过滤器过滤。

4.根据权利要求2所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c所述STC缓冲液的配制方法为：蔗糖50g，0.5M pH=8.0的Tris-HCl 25ml，CaCl2· 2H₂O 1.838g，用ddH₂O定容至250ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min。

5.根据权利要求5所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c所述PTC缓冲液的制备方法为：取PEG4000 60g，用STC缓冲液定容至100ml，65℃水浴锅加热溶解后，再用0.22um细菌过滤器过滤。