[发明专利]Sso7d-Sau重组DNA聚合酶

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和蛋白质工程领域，涉及一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶。

背景技术

在生物学研究、医学检验、法医鉴证及农业等相关领域，核酸的扩增都是一种非常重要的技术。目前，应用最为广泛的核酸扩增技术是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。PCR技术利用反应温度的循环变化来实现目的序列的变性、复性和延伸，能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。然而，由于PCR技术依赖体积大、耗电量高、价格昂贵的PCR仪来实现，限制了其在现场及田间检测中的广泛应用。

近些年，在DNA、RNA合成的分子生物学领域有许多的研究进展，许多在体内核酸扩增过程中发挥重要辅助作用的蛋白被相继发现。在这些研究进展的基础上，人们开发了多种恒温核酸扩增技术，如转录介导的核酸扩增技术、链置换核酸扩增技术、环介导核酸恒温扩增技术，及重组酶介导的核酸扩增技术等。与传统的PCR技术相比，恒温核酸扩增技术除了脱离PCR仪，能够在恒温条件下进行核酸扩增的优势以外，有一些恒温核酸扩增技术还对一些扩增反应的抑制因素具有更高的耐受能力。

重组酶介导的核酸扩增技术是新近开发的恒温核酸扩增技术之一。该技术模拟生物体内DNA的复制过程，利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白来介导模板链的解链以及实现模板和扩增引物之间的链替换；在SSB蛋白的辅助下，DNA聚合酶可以对链替换后的DNA实现特异性的延伸。该技术由ATP供能，并由磷酸肌酸催化实现ATP的再生。37℃恒温条件下，重组酶介导的核酸扩增技术能够在20-60min之内实现对目的片段的指数级别扩增。该技术还能够与SYBR green I，SYTO-13或SYTO-82等共同作用，利用肉眼可见荧光染料来对扩增结果进行判断。这样既可以避免反复开关反应管而造成交叉污染的问题，又无需依赖具有致癌性的核酸电泳试剂以及昂贵的凝胶成像系统，使得重组酶介导的核酸扩增技术的应用与传统的PCR技术相比更加便捷，也更加适用于现场和田间检测使用。

重组酶介导的核酸恒温扩增技术中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I(Bacillus subtilis Pol I，Bsu)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Pol I，Sau)，这两种DNA聚合酶均属于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是负责DNA复制过程中损伤修复的聚合酶，该家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力都不高，也就是说该家族的聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。

Sso7d是一种来源于嗜热菌种Sulfolobus solfataricus的非特异性DNA结合蛋白。有研究表明，将Sso7d与来源于DNA聚合酶I家族和II家族的高温DNA聚合酶共价连接，能够显著提高高温DNA聚合酶的持续合成能力。另外，还有研究证明，低温DNA结合辅助蛋白(37℃)能够在高温(60℃)发挥DNA结合的作用，也就是说，DNA结合蛋白有可能在非最适条件下也能正常发挥作用。因此，将Sso7d与低温DNA聚合酶Sau共价连接或许能够为DNA聚合酶的改造提供一种新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)N端共价连接来源于嗜热菌种Sulfolobus solfataricus的DNA结合蛋白Sso7d，力求克服DNA聚合酶I家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力不高的问题。

本发明的第二个目的是提供编码上述Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的基因。

本发明的第三个目的是提供上述Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的制备方法。

本发明的第四个目的是提供上述Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接Sso7d蛋白而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

二、编码上述的Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

三、上述的Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的制备方法，该方法包括以下步骤：