[发明专利]兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法

权利要求书

1.兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物，其特征在于所述引物序列为：

针对牛源猪瘟细胞苗的上游引物：BF1：5’- accataaagaactccatcaacaag -3’；

针对牛源猪瘟细胞苗的下游引物：BR1：5’- acccgtaatataagcctcgtc -3’；

针对兔源猪瘟脾淋苗的上游引物：RF1：5’- tcagacattcaaattttcgcatca -3’；

针对兔源猪瘟脾淋苗的下游引物：RR1：5’- ttaatagaggtaggtttggttgtg -3’。

2.利用权利要求1所述鉴别引物的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于所述鉴别方法的步骤如下：

1）提取待测猪瘟疫苗样品的DNA；

2）PCR扩增反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，所述第一轮PCR反应所用引物对为BF1/BR1和RF1/RR1中的一种，第二轮PCR反应所用引物对为BF1/BR1和RF1/RR1中的另一种；

所述两轮PCR反应体系均为25μL：包括Buffer 10mM，dNTP 0.2mM，Mg²⁺ 1.5mM，每种引物0.2mM，Taq 1U，待测猪瘟疫苗样品的DNA 50ng，用双蒸水补齐到25μL；

3）电泳染色对比图谱：取PCR扩增反应后的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录； 

如果引物对BF1/BR1扩增的样品出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品未出现一条大小为345bp片段，则表明该样品为牛源猪瘟细胞苗；

如果引物对BF1/BR1扩增的样品未出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品出现一条大小为345bp片段，则表明该样品为兔源猪瘟脾淋苗；

如果引物对BF1/BR1扩增的样品出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品出现一条大小为345bp片段，则表明该样品中含有牛源猪瘟细胞苗和兔源猪瘟脾淋苗。

3.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述699bp片段序列如序列表中序列1所示。

4.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述345bp片段序列如序列表中序列2所示。

5.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应和第二轮PCR反应的程序是95℃ 5min；95℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min，30个循环；之后72℃ 10min。

6.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，采用酚氯仿提取法提取待测猪瘟疫苗的DNA。