[发明专利]抗HCMV UL128基因284-304位点的siRNA序列及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对人巨细胞病毒UL128基因的siRNA序列的设计、筛选及其在体内外抑制人巨细胞病毒的应用。

背景技术

先天性耳聋是最常见的出生缺陷，其发生率约为0.1%~0.3%，已成为影响我国优生优育和人口素质的主要问题之一。人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）可通过胎盘、产道、母乳等途径在母婴之间传播，是导致感染性先天性耳聋最主要的病原体。儿童先天性感觉神经性耳聋中至少有40%可归因于HCMV感染，且HCMV感染的致聋率及耳聋严重程度与病毒负载量呈正相关。有症状的先天性HCMV感染患儿的耳聋发生率约为22%~65%，无症状患儿的耳聋发生率为6%~23%，而且感觉神经性耳聋是无症状的先天性HCMV感染最常见的后遗症。对动物巨细胞病毒感染性耳聋模型的研究显示，除病毒直接导致细胞病变效应外，炎症反应可能在耳聋发病机制中发挥了更重要的作用。

趋化因子（chemokine）是一类能趋化细胞定向移动的小分子细胞因子，根据其N端半胱氨酸残基的数目和位置可以分为CXC（                                               ）、CC（β）、C（）和CX₃C（）4个亚家族。病毒干扰宿主细胞趋化因子及其受体相互作用最直接的方式是自身表达趋化因子类似物。UL128为HCMV表达的类β-趋化因子，主要具有两方面的功能：⑴ 以单体形式存在时，发挥体外趋化人外周血单个核细胞（PBMC）、结合趋化因子受体、影响胞内钙离子浓度、激活信号转导通路等趋化因子功能；⑵ 与gH、gL、UL130、UL131A蛋白组成复合物，在HCMV侵入内皮和上皮细胞过程发挥重要作用。目前研究发现，在人内耳上皮细胞与PBMC的体外共培养模型中，UL128能显著促进炎症因子IL-6和TNF-α的释放。因此，UL128可能是HCMV感染性耳聋发病机制中的关键蛋白，抑制UL128的表达有望成为HCMV感染性耳聋防治的新手段。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是序列特异的双链RNA使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。RNAi的作用主要由长约21~23nt的小干扰RNA（siRNA）介导，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。RNAi靶点的选择原则主要包括：①从靶基因起始密码子下游50~100nt开始查找；②选择以AA或NA（N代表任意碱基）开始的序列；③选择GC含量在30%-52%左右的mRNA区域；④避免连续的单一碱基和反向重复序列；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNase Ⅲ降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。目前，RNAi已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗HCMV UL128基因284-304位点的siRNA序列，是针对HCMV UL128基因的有效siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GCTGCAACTACAATCCGTTAT-3’。

本发明的另一个目的是提供该cDNA序列在制备治疗HCMV感染性耳聋药物中的应用。

本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为42.9%，对应UL128 mRNA的284-304核苷酸位点。构建针对HCMV UL128基因的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染已感染HCMV的MRC-5细胞和人内耳上皮细胞，能有效抑制UL128基因的mRNA水平，因此可应用于人巨细胞病毒治疗药物的制备。

本发明的有益之处是：提供的siRNA序列针对HCMV的类β-趋化因子编码基因UL128，目前国内外尚无用siRNA表达载体法筛选HCMV UL128基因有效siRNA序列的报道。以此序列为基础的真核表达载体具有在细胞中持续、有效抑制UL128基因mRNA的优点，故可作为HCMV感染性耳聋防治的一个新靶点。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

实施例1  siRNA真核表达载体体外抑制UL128-EGFP融合蛋白的表达