[发明专利]一种提取梨花粉管液泡的方法

权利要求书

1.一种提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23～27 ℃，140~200 rpm，培养3~4 小时；所述的花粉培养基配方为：100 g/L蔗糖，0.3 g/L Ca(NO₃)₂4H₂O，30 mM MES，0.1 g/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5.9~6.4；

2）原生质体的释放：将培养好的花粉与胞外液按照1:2~5的体积比混合，加入0.5~1.5%的纤维素酶、0.5~1.5%的离析酶，23～27 ℃，黑暗条件下，60~80 rpm，反应10~15分钟；所述的胞外液配方为：100 mM 葡萄糖，10 mM CaCl₂，5 mM MES，0.8-1M山梨醇，用Tris将pH调至5.5~6.0；

3）原生质体的纯化：将上一步所得含原生质体的液体通过200-250目的细胞筛去除未酶解的花粉管，滤液加入到离心管中，静置2-5分钟后吸取上清，上清液离心，去除上清液，再用胞外液清洗沉淀去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；

4）液泡的分离：将液泡溶解缓冲液加入到上一步获得的花粉管原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，观察液泡出现情况；液泡溶解缓冲液配方为：0.3-0.35 M山梨醇，2-4 mM EDTA，2-5 mM DTT和0.005%的中性红，用Tris将pH调至7.5~8.0；

5）液泡的纯化：将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll-400密度梯度工作液顶部离心，在25000~28000 rpm、8~10℃下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12~15% 浓度顶部淡红色的一层为液泡，将其吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为所述的梨花粉管液泡；所述的Ficoll-400密度梯度工作液浓度分别为：2~4%、6~8%及12~15%。

2.根据权利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）花粉采集：采集大蕾期花药，干燥，干燥硅胶阴干；

2）花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23～27 ℃，140~200 rpm，培养3~4 小时；

3）原生质体的释放：将培养好的花粉与胞外液按照1:3的体积比混合，加入1%的纤维素酶、1%的离析酶，23～27 ℃，黑暗条件下，60~80 rpm，反应10~15分钟；

4）原生质体的纯化：将步骤3）所述液体通过200-250目的细胞筛以去除未酶解的花粉管，重复3次，滤液加入到离心管中，静置2-3分钟后吸取上清，上清液在100×g、10 ℃下离心10分钟，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；

5）液泡的分离：将液泡溶解缓冲液加入到步骤4）获得的原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，显微镜下观察液泡出现情况；

6）液泡的纯化：将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll-400密度梯度工作液顶部离心，在26000 rpm、10℃下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12~15%浓度顶部淡红色的一层为液泡，用剪过的移液枪头吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为液泡。

3.根据权利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方为： 12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含2~4%、6~8%及12~15% 三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于pH 7.5~8.0的含0.5 M的山梨醇，5mM CaCl₂和25 mM Tris-HCl 缓冲液中配成要求的浓度。

4.根据权利要求3所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方为： 12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含3%、8%及13% 三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于pH 7.5~8.0的含0.5 M的山梨醇，5mM CaCl₂和25 mM Tris-HCl 缓冲液中配成要求的浓度。