[发明专利]一种天然二硫键与阿魏酸酯酶A功能相关性的验证方法

说明书

技术领域

本发明涉及宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株阿魏酸酯酶A(AuFaeA)结构的同源建模，突变阿魏酸酯酶AuFaeA^C29T、AuFaeA^C91T和AuFaeA^C234T工程菌的构建及重组突变阿魏酸酯酶的异源表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)又称为肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，从属于羧酸酯酶(EC 3.1.1-)亚家族。该酶能够水解植物细胞壁中肉桂酸与阿拉伯木聚糖之间及其与一些果胶之间相连的酯键，从而释放出阿魏酸或二聚体阿魏酸。根据阿魏酸酯酶一级结构相似性和对4种模式底物阿魏酸甲酯(MFA)、咖啡酸甲酯(MCA)、对香豆酸甲酯(MpCA)和芥子酸甲酯(MSA)的特异性等因素，将阿魏酸酯酶进一步分为A、B、C、D四类。至今，仅有源于黑曲霉的A类阿魏酸酯酶的晶体结构得到解析，且该类酶结构中存在3个天然的二硫键。

据报道，一个二硫键的形成可以为蛋白质的热稳定性贡献2.3-5.2kcal/mol的能量，有时二硫键还对蛋白质的功能发挥起到促进或抑制的作用。Le等将二硫键C162-C308引入源于Candida antarctica的脂肪酶B，使得该酶在50℃的半衰期提高了4.5倍。Wang等将二硫键C1-C24引入源于Thermomyces lanuginosus的木聚糖酶TLX，使得该酶的最适作用温度提高了10℃。相反的，源于Pseudomonas fragi的脂肪酶PFL由于二硫键的缺失而导致该酶的热稳定性等性质明显下降。因此，验证二硫键与蛋白质功能的相关性可以从两个方面验证，其中之一即将蛋白质中的天然二硫键打断，但是对于A类阿魏酸酯酶在这方面的研究还鲜有报道。随着基因工程技术等的快速发展，运用该手段对阿魏酸酯酶A分子进行改造即可验证改造位点对酶蛋白功能的影响，为分子生物学的发展及其它酶类的改造提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种天然二硫键与阿魏酸酯酶A功能相关性的验证方法，以及突变阿魏酸酯酶A工程菌构建、突变酶异源表达的方法。

本发明的技术方案：根据来源于A.usamii E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的模拟空间结构分别设计单突变C29T、C91T和C234T，得到突变阿魏酸酯酶A：AuFaeA^C29T、AuFaeA^C91T和AuFaeA^C234T，分别验证单个二硫键的缺失对酶功能的影响，其成熟肽基因AufaeA^C29T、AufaeA^C91T和AufaeA^C234T序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。

所述的由成熟肽基因编码得到的AuFaeA^C29T、AuFaeA^C91T和AuFaeA^C234T氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。

所述的重组阿魏酸酯酶A的活性测定方法：

以MFA为底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作为：移取900μL MFA(1mM，pH 6.0)于2mL EP管中，45℃保温10min，加入100μL适当稀释的酶液，反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、1％乙酸一步梯度洗脱，在10min内，甲醇浓度由50％上升至80％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长320nm，上样量20μL。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义：在测定条件下(45℃、pH 6.0)每分钟产生1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。

所述的突变阿魏酸酯酶A基因的设计、克隆及表达：

(1)氨基酸残基突变位点的选定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三维结构(1UWC)为模板，用Modeller 9.9软件模拟出AuFaeA的三维结构。由其三维结构观察天然二硫键的位置确定突变氨基酸位点以打断单一天然二硫键。