[发明专利]一种添加二硫键以提高阿魏酸酯酶A热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株阿魏酸酯酶A(AuFaeA)基因的热稳定性改造，突变阿魏酸酯酶A工程菌的构建及重组突变阿魏酸酯酶A的高效表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞外酶，能打断半纤维素之间的、半纤维素与木质素之间交联的酯键，是半纤维素降解酶系的组成成分之一。自1991年Faulds等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过30种阿魏酸酯酶被克隆、表达及纯化，其主要生物功能是水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。但研究结果表明，天然阿魏酸酯酶的热稳定性一般较差，成为其在食品加工、饲料(制粒)、造纸行业(纸浆漂白)等诸多领域中应用的瓶颈。

由于高温生物工程环境限制了阿魏酸酯酶的应用，所以人们加强了对酶热稳定性的研究。希望可以通过提高酶作用温度和增加酶热稳定性，从而提高酶作用效率，以达到降低工业生产成本的目的。目前，开发耐热型阿魏酸酯酶的研究主要包括筛选自然界中超耐热的阿魏酸酯酶生产菌和利用蛋白质工程技术等对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的青睐。随着基因工程技术、生物信息学等的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的道路。通过运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，从而扩大阿魏酸酯酶的应用面。

发明内容

本发明的目的是提供一种阿魏酸酯酶A热稳定性改造、突变阿魏酸酯酶A工程菌构建以及突变阿魏酸酯酶A高效异源表达的方法。

本发明的技术方案：根据来源于A.usamii E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的空间结构设计突变A126C和N152C，得到突变阿魏酸酯酶A：AuFaeA^A126C-N152C，其成熟肽基因AufaeA^A126C-N152C序列为SEQ ID NO:1，C126和C152可以形成二硫键。

所述的由成熟肽基因编码得到的AuFaeA^A126C-N152C氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

所述的重组阿魏酸酯酶A的活性测定方法：

以阿魏酸甲酯(MFA)为底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作为：移取900μL MFA(1mM，pH 6.0)于2mL EP管中，45℃保温10min，加入100μL适当稀释的酶液，反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、1％乙酸一步梯度洗脱，在10min内，甲醇浓度由50％上升至80％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长320nm，上样量20μL。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义：在测定条件下(45℃、pH 6.0)每分钟产生1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。

所述的突变阿魏酸酯酶A基因的设计、克隆及表达：

(1)氨基酸残基突变位点的选定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三维结构(1UWC)为模板，用Modeller 9.9软件模拟出AuFaeA的三维结构。利用Discovery Studio 3.0Client、PyMOL和Disulfide By Design软件对模拟的三维结构进行分析，并用gromacs-4.5程序包对改造前后的三维结构进行动力学模拟，最终确定氨基酸残基突变位点。

(2)突变基因AufaeA^A126C-N152C及其表达质粒的构建：根据已申请发明专利(申请号：201210181372.X)中核苷酸序列及突变位点特点设计突变引物126-F，152-R：

126-F：5’-ATCCGGACTATTGCCTTACCGTGACA-3’，

152-R：5’-GTACAGACGGACGCAGTCATATGTCGC-3’，