[发明专利]猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物抗体制备技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV-2)为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，于1991年在加拿大被首次发现并报道。目前PCV2的致病机制还不十分清楚，其对免疫系统的破坏被公认为是引起相关猪病的重要原因，猪由于免疫系统功能降低，在应激和病原感染时容易遭受病原侵袭，可能表现严重的症状。其临床症状主要表现为进行性消瘦，贫血和黄疸。近年来我国规模化猪场断奶仔猪也出现该病，给养猪生产造成较大的损失。到目前为止，国内尚无有效疫苗预防，也无有效药物治疗。

目前，PCV2在我国及其他国家猪群中的感染率相当高，国内已从不同地区有或无PMWS症状猪分离鉴定了许多株PCV2，但关于不同地区流行的PCV2基因型、致病性及其毒力的分子基础等问题仍然不清楚。因此目前很难对PCV2的感染做出很好的防控。虽然高免卵黄具有价廉、速效、生产工艺简便等特点，但高免卵黄含有大量的脂类和杂蛋白，造成难于注射和吸收及产生过敏反应等问题。因此找出有效、经济、简单的提取卵黄抗体方法，是推广应用高免蛋的一个关键问题。

发明内容

本发明目的是提供制备猪圆环病毒2型组织灭活苗，免疫鸡，收集高免卵后制备卵黄抗体，用于治疗发病猪。

采用如下技术方案：一种猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

第一步，自制疫苗：

（1）先配制0.8％甲醛、0.1％叠氮钠和l000U/mL双抗液备用；

（2）再将无菌采集发病猪的肺脏、肝脏和脑及淋巴结组织，用l000U/mL的双抗液冲洗表面；除掉筋膜，切成小块；

（3）组织称重后按1：2的比例加入20％铝胶生理盐水，在高速匀浆机中匀浆2～3min，超声波裂解10min～15min，再以2000r／min匀浆4～5min，加入铝胶生理盐水，加入生理盐水的总量为组织重量的四倍；

（4）在无菌室内，用灭菌纱布过滤、分装，最后进行灭活；

（5）向匀浆后的组织液中加入等量的0.8％甲醛，O.l％叠氮钠，在冰箱冷冻室反复冻融3次以上，室温放置12h后，于4℃冷藏保存；

（6）经无菌检查、安全试验、效力试验后，4℃冷藏保存；

第二步，制备高免卵黄抗体：

（1）基础免疫每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.2mL；

（2）在基础免疫后l5天，每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.3mL,加强免疫；

（3）在加强免疫后l5天，每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.4mL,强化免疫；

（4）强化免疫后15天抽检卵黄，抗体效价最低达1:128，用于制作卵黄抗体；

（5）采集强化免疫后第15～30天所产鸡蛋作为高免蛋,擦去鸡蛋表面脏物,浸泡于0.1％浓度的新洁尔灭溶液中30min后晾干；

（6）用75％酒精棉球进行蛋壳表面消毒,无菌操作打开蛋壳,倒净蛋清,将蛋黄倒入消毒玻璃烧杯内备用；

（7）将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释,将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释，调pH值至7.4，加入1.2%硫酸葡聚糖，静置，离心，取澄清液，进行硫酸铵分级得到卵黄抗体,除菌过滤，然后加入0.O1％硫柳汞,分装加塞,冰冻备用。

对所述高免卵黄抗体的检验方法：

（1）无菌检验：取高免卵黄分别接种于普通琼脂斜面培养基和厌氧肉汤培养基,37℃培养24～48h；

（2）性状检验：将高免卵黄解冻后观察其颜色、气味、和均匀度以达标为准；

（3）安全性检测：取小白鼠10只，每只皮下注射高免卵黄液2ml；另取15日龄仔猪10头,腹部部皮下注射lOml／头,观察3周；

（4）效价检验：用琼脂扩散方法测定，效价高于1：32者用于临床。

人工感染治疗试验方法：

（1）选取保育猪20头,随机分为两组,每组10头,一组为试验组,一组为对照组；

（2）取自然发病的猪脾脏和淋巴结,经组织匀浆处理后离心，取上清液。经预试验后每头猪注射含圆环病毒2型的上清液10mL；

（3）待猪发病后，一组用高免卵黄（每公斤0.05mL/kg体重注射）+庆大霉素肌肉注射,另外一组用生理盐水（每公斤体重0.05mL注射）+庆大霉素肌肉注射,观察其治疗效果。

以上方案具有如下效果：