[发明专利]基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法

说明书

技术领域

本发明涉及将微流控芯片技术应用到体内组织工程的模拟与应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法。

背景技术

在体外三维培养的方式中，多细胞微球的方式由于能模拟体内的细胞之间的相互作用和功能近年来得到很高的关注。上世纪90年代发展起来的微流控技术，又被称为芯片实验室。借助该技术，可以以可控的方式构建复杂，动态的细胞微环境，因此被广泛运用于细胞生物学和细胞生物医学研究中。该平台技术也为细胞三维培养和细胞检测提供了新的思路。微流控芯片可以制作微米尺度的结构，可用于细胞微球的形成，同时由于该技术的条件灵活性，可以构建更加贴近生物环境的仿生结构。尽管目前的研究已经报道了在微流控芯片上利用微结构形成细胞微球研究细胞的行为，但是由于三维细胞球的复杂结构，常规的检测方式如荧光显微镜不能精确的分析，有时需要脱离芯片进行三维结构特征的生物学分析，所以在微流控芯片上进行细胞微球的精确控制和释放是迫切需要的。在微流控技术中可以加入微通道和集成微阀等功能单元，同时对于细胞进行精确控制并实现营养物质交换。

发明内容

本发明提供了基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，利用多层微流控芯片，可实现高通量的多尺寸的细胞微球形成，细胞微球的培养和微球的可控释放。该方法既可用于高通量的细胞微球的产生和操控，又有利于细胞的在线和离线检测，为干细胞分化和药物筛选等应用提供了一种新平台。

一种微流控芯片，该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，

所述气路控制层包括气阀控制口，气阀控制通道，所述气阀控制通道2为Z形状，气阀控制口位于气阀控制通道的右侧端，与废液通道同侧；

所述流体液路层包括进样口，分液通道，细胞接种室和废液通道；进样口连接分液通道，分液通道连接细胞接种室，再连接废液通道；

所述凹陷微结构层为含有凹陷结构的凹陷阵列结构；

所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。

所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。

凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。

所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。

气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。

一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：

(1)细胞三维微球的形成

将软骨细胞消化后，以6×10⁶cells/mL密度接种入芯片进样口，细胞悬液经过分液通道到达细胞接种室中，恒温培养箱37度中培养24h后，细胞在重力的作用下聚集成球，芯片每天更换培养基；

(2)细胞三维微球的释放

细胞在培养24h后形成细胞微球后，微流控芯片气阀控制通道被连接上了气阀控制器，芯片入口处利用四氟管连接PBS溶液，利用注射泵推动PBS溶液，流速为1μL/h；在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放；

(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察

软骨微球在微流控上芯片培养7天后，统计软骨细胞微球的直径，同时对软骨细胞微球进行了荧光染色分析，考察了软骨细胞微球II型胶原和蛋白多糖的表达。

在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的可控释放。

微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。

所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。

本发明提供的微流控芯片，在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放。微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。