[发明专利]一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法

权利要求书

1.一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)琼脂糖凝胶Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝胶，活化过程如下：

a)取10mlSepharose6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去离子水分两次洗涤后抽干，再加入少量0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；

b)在通风橱内称取1g溴化氰，加去离子水10ml溶解，然后分批加入Sepharose6B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/LNaOH,使得pH维持在10.5，待溴化氰溶液滴加完毕，继续搅拌30分钟，pH保持不变，停止搅拌；

c)将活化的Sepharose6B加入小冰块，迅速导入布氏漏斗中，以冰水抽滤，并调节pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃溶液抽洗备用；

2)人血清前白蛋白免疫亲和柱的制备：

人血清前白蛋白与琼脂糖凝胶Sepharose6B偶联得到亲和吸附填料，填入玻璃柱中制得人前白蛋白免疫亲和柱，操作步骤如下：

c)偶联

以纯化制备获得的人血浆载脂蛋白A-I纯品作为配基，采用GEAKTA^TM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrap^TMDesalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：pH8.3的内含有0.5MNaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶联缓冲液；

步骤1)活化好的Sepharose6B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入人血浆载脂蛋白A-I蛋白溶液中进行偶联，蛋白检测仪监控偶联过程；用10倍体积以上的偶联缓冲液去除未偶联的人血浆载脂蛋白A-I溶液，得到Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白偶联复合物；收集全部洗脱液，通过测定其蛋白质含量计算偶联率；

d)封闭活性基团

将Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白偶联复合物转入5倍体积pH8.0的内含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-HCl缓冲液中，旋转震荡约2h,以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；

e)洗涤

步骤1)得到的Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白偶联复合物依次用10倍偶联复合物体积的pH4.0的内含有0.5MNaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和5倍体积的pH8.0的内含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-HCl缓冲液中洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用10倍偶联复合物体积的PBS洗涤2次；

f)装柱

将上述得到的Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白偶联复合物填充5ml或10ml固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白免疫亲和柱；

g)保存

步骤(f)制备好的Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白偶联复合，使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2～8℃密封保存；

3)纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体：

取免疫后羊抗人血清人血浆载脂蛋白A-I抗血清200ml，依次用0.8um、0.45um微孔滤膜过滤，滤液过制备的Sepharose6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白亲和柱，柱子用含50ml的PBS预处理：分别用50ml含0.5MNaCl的PBS淋洗杂质组分，紫外检测器检测吸光度平衡后，用pH4.0的内含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱液经HiTrap^TMDesalting脱盐柱置换成PBS缓冲液后，自动生化仪AU400上机，标准品定标测试，观察定标曲线的线性。

2.根据权利要求1所述一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2)d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换采用的脱盐柱体系选自HiTrapTMDesalting或Hiprep26/10Desalting。

3.根据权利要求2所述一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2)d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换采用的脱盐柱体系为HiTrap^TMDesalting。