[发明专利]牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和测序方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和测序方法。

背景技术

漆酶(Laccase)是一种糖蛋白，肽链一般由500个左右氨基酸组成，糖配基占整个分子的10％～45％。糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。尽管漆酶的氨基酸序列同源性差异很大，一般不同来源的漆酶同源性低于50％，但其催化位点序列还是非常保守的。通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究，发现漆酶具有3个铜离子结合位点，共结合有4个铜离子，根据它们的氧化还原电势、光学和磁学特征划分为三种类型。

第一类铜离子(Cu1)能与包括水在内的溶剂作用，各种铜离子络合剂能将其除去导致酶的活性大大减少。第二类铜离子(Cu2)是由两分子的咪唑和一分子的水配位形成松散的扭曲四面体几何构型，所以很容易除去，在有氧条件下则不易除去。第三类铜离子(Cu3a，Cu3b)与三个组氨酸分子和一个氢氧化物分子形成受阻四面体几何构型，在有氧分子存在时，这对铜离子由氢氧化物为桥结合在一起，Cu-Cu工价体产生强烈的反铁磁性，检测不到EPR光谱信号。这类二价复合物在330nm处的吸收随活性位点的还原而消失。

漆酶能催化许多化合物的氧化反应，底物比较广泛，包括许多对二酚结构类似的化合物，如氨基苯酚，邻、对苯二酚，多胺，木质素和芳基二胺等。一些漆酶能高效的氧化抗坏血酸，另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂，有卤化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等，离子强度的不同也会影响酶的活力。不同来源的漆酶最适pH范围也不同。

漆酶的活性与真菌的出芽、色素生产、木质素降解和病源发生相关，同时漆酶还可以保护真菌病原菌免受寄主植保素和鞣质等化合物的影响，所以漆酶被认为是重要的病原菌毒力因子。例如根病原菌Heterobasidionannosum的侵染性和漆酶紧密相关。

漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素，存在菇、菌及植物中，有关真菌漆酶的研究与应用已有大量报道。真菌漆酶因为具有降解木质素、酚类物质的作用，所以在纺织、造纸、食品、饲料、环保等方面具有广泛的应用潜力。分泌漆酶的主要真菌有黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇、香菇等，这些真菌都属于担子菌门。

漆酶在植物中主要起到合成木质素的作用，而真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反，主要起降解木质素的作用，因此真菌漆酶对木质素的降解作用使漆酶具有广泛的潜在应用价值。牛樟芝是珍贵的药用真菌，是牛樟树上发现的唯一腐木菌，但是樟芝的寄生病源性并不强，牛樟树很少死亡，所以，研究牛樟芝的漆酶具有重要意义。本发明参考其它物种Laccase基因序列，克隆测序获得牛樟芝Laccase基因的cDNA序列，并对不同物种Laccase基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证Laccase基因的结构特点，为今后研究Laccase基因与菌类漆酶提供基础资料。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种牛樟芝Laccase蛋白基因。

本发明的另一个目的在于提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和测序方法。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种牛樟芝Laccase蛋白基因，该基因为一种漆酶的基因，具体来说，本发明的实施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

同时，本发明的实施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因，其核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明的实施方式还提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和测序方法，该方法包含以下步骤：

(1)组织分离：取牛樟芝菌丝，以重蒸水冲洗去除培养基及杂质，然后将组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70℃保存；

(2)总RNA的分离：从上述步骤(1)中冻存的组织样中提取总RNA，通过分光光度计测定RNA含量，并采用琼脂糖电泳分析进行总RNA的鉴定；