[发明专利]一种靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列

说明书

技术领域

 本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。更具体地，涉及一种靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列。

背景技术

地中海贫血（Thalassemia，简称地贫）是全球最常见、对人类健康危害最大的单基因遗传病之一。β-地中海贫血（β-thalassemia，简称β-地贫）的分子遗传学基础是由于β珠蛋白基因的缺失或突变，导致β珠蛋白链合成障碍所引起的溶血性贫血。因为β珠蛋白链的合成不足或完全不能合成，引起α与非α珠蛋白链的合成比例不平衡，影响正常血红蛋白的合成；此外，由于α-珠蛋白链的相对过剩，剩余的α-珠蛋白链在红细胞内形成包涵体，导致红细胞膜的氧化损伤，造成红细胞破坏及骨髓的无效造血。据现有流行病学调查资料显示，我国广东省人群的β-地贫携带率为2.54~3.36%，是广东省发病率高、危害性大的出生缺陷之一，被列为广东省出生缺陷重点干预病种。

随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展、人类对珠蛋白基因结构、表达调控研究的深入，基因治疗成为了β-地贫治疗的希望。目前β-地贫基因治疗的策略包括将正常功能的γ-珠蛋白或β-珠蛋白基因插入患者的自体造血干细胞，以及通过抑制α-珠蛋白基因的表达来改善α/β珠蛋白的合成失衡。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。而对于RNA干扰技术来说，能够实现目的的表达抑制，抑制效果的好坏差别，siRNA片段序列的设计和优化是最关键的因素之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有地中海贫血治疗药物和技术的缺陷和不足，提供一种能够靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列，该siRNA序列能够特异性地高效抑制α-珠蛋白基因的表达，从而改善β地贫患者α/β珠蛋白的合成失衡，为制备β-地贫治疗药物奠定基础。

本发明的目的是提供一种能够靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列。

本发明另一目的是提供所述siRNA序列在制备β-地贫治疗药物方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列为HBA2 siRNA1序列，包括正义链和反义链；正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列在制备α-珠蛋白基因表达抑制剂方面的应用。

更重要是本发明提供了所述靶向抑制人α-珠蛋白基因表达的siRNA序列在制备β-地中海贫血治疗药物方面的应用。

α/β珠蛋白生成比例不平衡是β-地贫的主要病理机制，本发明应用siRNA介导的RNAi技术可以高效、特异、方便的抑制人α-珠蛋白基因的表达，从而改善β地贫患者α/β珠蛋白的合成失衡，为构建siRNA治疗β-地贫的药物和技术体系奠定基础。

本发明首先根据生物信息学的方法，在genebank获取人α-珠蛋白mRNA序列（V00489.1），采用RNA structure分析软件对人α-珠蛋白1 mRNA序列的二级结构进行预测，结合siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性等要求，设计siRNA序列。最后再根据该软件对设计出的siRNA系列进行评价，进一步采用NCBI GenBank（美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写）提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，最终筛选出1条特异性最好的一组siRNA序列。

人工合成上述设计的siRNA序列后，设计构建基因重组慢病毒载体，并在HEK 293T细胞进行慢病毒包装，利用终点稀释法验证慢病毒包装以及检测病毒的感染性滴度，评价该siRNA序列对α-珠蛋白基因的抑制作用和抑制效果，结果显示，本发明的siRNA序列能够特异性地高效抑制α-珠蛋白基因的表达，为构建siRNA治疗β-地贫的药物和技术体系奠定了基础。

本发明具有以下有益效果：