[发明专利]一种杂合抗菌肽CE-PR及其应用

权利要求书

1.一种杂合抗菌肽CE-PR，其特征在于，所述的杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.权利要求1所述的杂合抗菌肽CE-PR的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)根据新型杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中；

2)将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；

3)阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天；待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；

4)将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时；取此菌液按4％体积比转接于5ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6；培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28℃继续摇振培养；为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％；48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定；能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型杂合抗菌肽CE-PR的阳性菌株；

5)重组酵母菌株的发酵工艺：将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入发酵罐，在28-30℃，500-1500r/min，pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h；

发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。

3.权利要求1所述的杂合抗菌肽CE-PR在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。