[发明专利]一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法

权利要求书

1.一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：

所述方法的具体步骤如下：

(1)对他达那非进行肟化衍生化方法，并把肟化他达那非分别连接到阳离子化牛血清白蛋白和卵清蛋白载体，构建把他达那非及其类似物共同结构暴露在外部的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原和人工检测抗原；

所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原的合成方法如下：采用改良活性酯法合成免疫抗原，将0.5mg半抗原溶于0.5mL无水甲醇，再加入0.05g碳二亚胺和0.01g N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心分离沉淀物，取上清液，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸缓冲液的含5mg阳离子化牛血清白蛋白的溶液中，室温震荡反应4小时，生理盐水透析72小时除去未反应的他达那非及其类似物，每6小时换透析液一次，分装冻存于-20℃冰箱；

所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原的合成方法是将肟化他达那非用碳二亚胺法与卵清白蛋白偶联合成；

(2)使用突出他达那非及其类似物共同结构的人工免疫抗原免疫家兔，诱导产生抗他达那非及其类似物多克隆抗体，收集血清并使用免疫亲和层析法纯化得到抗他达那非及其类似物特异性抗体；

(3)胶体金的制备；

(4)将抗他达那非及其类似物特异性抗体标记于纳米胶体金；

(5)把抗他达那非及其类似物特异性抗体标记在在硝酸纤维素膜NC膜载体的检测线T线上，羊抗兔IgG固化在质控线上，构建胶体金检测卡；

(6)检测样品时在样品检测溶液中添加检测抗原，在检测过程中NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体分别与检测抗原上的他达那非及其类似物共同结构结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号，样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T线颜色会消失。

2.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的他达那非肟化衍生化方法的具体步骤如下：取2mg他达那非溶解在2mL无水吡啶溶液中，加入5mg羧甲基羟胺，室温摇晃反应过夜，次日把吡啶用旋转蒸发仪蒸干，用5mL碳酸氢钠溶液溶解反应物，弃去沉淀，然后用盐酸调节pH值到3.0，用乙酸乙酯抽提，弃去水相，将收集的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干，得到肟化他达那非。

3.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原的合成方法如下：采用碳二亚胺法合成检测抗原，将0.2mg肟化他达那非溶于0.5mL无水甲醇，加入到1.0mL含5mg阳离子化卵清白蛋白的碳酸缓冲液溶液中，再加入0.05g碳二亚胺和0.01gNHS，室温下震荡反应过夜，离心分离沉淀物，取上清液，磁力搅拌反应4小时，生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非活泼酯，每6小时换透析液一次，分装冻干备用。

4.如权利要求1或3所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：所述的碳酸缓冲液的pH＝8.5。

5.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(3)中，胶体金采用常规的柠檬酸还原法制备。

6.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(5)的具体步骤为：用微定量喷头喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，抗他达那非及其类似物抗体作为检测线，羊抗兔IgG作为质控线，用定量喷头喷涂金标记抗他达那非及其类似物抗体于玻璃纤维素膜上，干燥硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜后备用。

7.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(6)的具体步骤为：取0.2g或0.2mL样品，溶解在2.0mL无水乙醇中充分抽提目标检品，抽提液静止10分钟使杂质充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL在含有0.05mg/mL他达那非检测抗原的样品检测液，充分摇匀成为样品检测液，用滴管在样品垫上滴加3-4滴液样品检测，羊抗兔IgG和他达那非及其类似物偶联OVA结合物分别喷涂在NC膜的质控线和检测线T线，含他达那非及其类似物待测样品经S端根据层析原理向另一端移动，并先后越过检测线和质控线，由于样品检测溶液中存在检测抗原，NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体分别与检测抗原结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号，当样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T线颜色会消失。