[发明专利]一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株有效

专利信息
申请号: 201410777845.1 申请日: 2014-12-16
公开(公告)号: CN104480028B 公开(公告)日: 2018-02-23
发明(设计)人: 宋清清;徐晓东;徐娟;吴佳鹏;黄亦钧;王华明 申请(专利权)人: 青岛蔚蓝生物集团有限公司
主分类号: C12N1/15 分类号: C12N1/15;C12N9/20;C12R1/685
代理公司: 青岛海昊知识产权事务所有限公司37201 代理人: 曾庆国
地址: 266061 山东省青岛市*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 稳定 高产 脂肪酶 曲霉 突变 菌株
【说明书】:

技术领域

发明属于微生物诱变筛选技术领域,具体涉及一种稳定高效表达脂肪酶的黑曲霉(Asperillus niger)突变菌株。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶,是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。从催化特性看,它具有高度的化学选择性和立体异构性,且反应不需辅酶,反应条件温和,副产物少。脂肪酶的一个显著特征是它不同于多数水解酶的催化特性,它是一类非水相酶,其催化反应是在油水界面上进行,对于水溶性底物不起催化作用。因此脂肪酶广泛应用于有机合成当中,已成为市场上的第三大工业用酶。

1994年Uppenberg et al.公布了脂肪酶CALB(Candida Antarctica Lipase B)的氨基酸序列和三维(3D)结构。所述3D结构可以在结构生物信息学蛋白质数据库(RCBS PDB)(http://www.rcsb.org/)中找到,其识别号为1TCA。该酶具有宽广的底物谱,可催化底物的酯化、醇解、酸解、酯交换等反应,用于手性胺、手性醇等中间体的催化合成方面。具有方法简单、条件温和、能耗低、副产物价值高的优点。但目前国外酶制剂企业垄断经营的脂肪酶CALB表达量普遍较低,因此价格居高不下,不适合其在催化领域的进一步应用。在我国乃至世界精细化学品、中间体生产的工业化过程中,急需获得酶活单位高,生产成本低廉的工业化脂肪酶生产菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定、高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株,本发明将构建得到的重组表达脂肪酶CALB的黑曲霉工程菌株进行紫外诱变和突变筛选,从而获得了一株稳定性好、脂肪酶产量高的黑曲霉突变株,为脂肪酶CALB的工业化生产奠定了基础,从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一株突变菌黑曲霉CALB7-7(Aspergillus niger CALB7-7),已于2014年11月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2014584。

上述的突变菌黑曲霉CALB7-7,是将转化有携带编码脂肪酶基因的重组质粒的黑曲霉菌株进行紫外诱变获得的;

所述的脂肪酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:2;其编码基因的序列为SEQ ID NO:1。

本发明的黑曲霉CALB7-7用于生产脂肪酶。

本发明采用紫外诱变的方法获得一株突变菌株黑曲霉CALB7-7,该菌株能稳定、高效重组表达脂肪酶CALB,其发酵酶活高达210U/mL,比出发菌提高了75%。此外,该突变菌株重组表达的脂肪酶CALB的最适作用温度为45℃,最适作用pH值为7.0,与出发菌株相同,脂肪酶的酶学性质未发生改变。因此,该突变菌株可有效应用于脂肪酶CALB的发酵生产,有利于实现脂肪酶CALB在工业领域的广泛使用。

附图说明

图1:12%SDS-PAGE电泳检测分析图谱;

其中泳道M为蛋白标准分子量标记;泳道1所示为对照宿主菌黑曲霉G1发酵上清液中蛋白表达情况;泳道2所示为出发菌黑曲霉C11发酵上清液中蛋白表达情况;泳道3-10所示为8株突变菌发酵上清液中蛋白表达情况,箭头所指33kDa处的蛋白条带即为重组表达的脂肪酶CALB。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常可按常规条件,如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是,本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例,而应包括本领域技术人员在本说明书基础上,不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1 脂肪酶基因的合成及扩增

根据NCBI公布的脂肪酶CALB的基因序列(GeneBank Z30645.1),在其起始密码子ATG前增加8个碱基TCTAGAGC(下划线所示为XbaI酶切位点),在其终止密码子TGA后增加9个碱基CCGCTCGAG(下划线所示为XhoI酶切位点),然后将此序列根据黑曲霉密码子偏好性进行密码子优化,优化后的基因序列为SEQ ID NO:1,并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

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