[发明专利]一种生产柚苷酶的方法

权利要求书

1.一种生产柚苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；

（3）离心分离液体发酵液，取上清液；

（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述步骤（1）中，所述斜面培养基，每1L中含有以下成分：MgSO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、KCl 0.5g、KNO₃ 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉15g、琼脂 20g，pH为6.0，1×10⁵ Pa 灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述步骤（2）中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分：

麦芽糖15.1g、胰蛋白胨 10g、（NH₄）₂HPO₄ 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；

或者，柚皮苷10g、胰蛋白胨10g、（NH₄）₂HPO₄ 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；

或者，MgSO₄ 0.5g、 KH₂PO₄ 1.5g、 CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、 KCl 0.5g、KNO₃ 1.5g、酵母膏 2、桔皮粉7.5g，pH 为6.0。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

上述步骤（3）中，液体发酵液经超声波破壁后离心分离；超声波频率为25-30Hz，超声时间为10min，超声2.5s，停2.5s；离心的转速为5000－6000rpm，离心时间为10－15min。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

上述步骤（4）中，在离子交换层析之后、凝胶过滤层析之前，用0.01-0.5mol/L NaCl进行洗脱。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中硫酸铵分级沉淀的具体步骤为：向上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为0.01％－40％，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为40％-80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

    所述步骤（4）中离子交换层析，其具体步骤为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min；吸附过后用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中凝胶过滤层析的具体操作为：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/LNaCl溶液，流速0.1mL/min，平衡柱料；平衡后以相同缓冲液洗脱，流速保持在0.1mL/min，设置每管收集1mL；检测每管中柚苷酶活力和蛋白质含量。

9.一种采用权利要求1-8中任意一项所述方法获得的柚苷酶。

10.根据权利要求9所述的柚苷酶，其特征在于，分子量为32.5 kDa，最适作用温度、pH分别为45℃、7.5；总酶活力为10556U，比酶活力达15609U/mg。