[发明专利]一种利用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜方法

说明书

技术领域

本发明属于结核分枝杆菌致机制及耐药性研究技术领域，具体涉及一种利用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜方法。

背景技术

结核病是一种古老的传染病，是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患、慢性、消耗性疾病。目前结核病是仅次于艾滋病的全球三大传染性疾病之一。结核病的最常发病部位为肺部，可通过空气传播。随着二十世纪四十年代一系列抗结核药物的出现，结核病得到有效控制，但是耐药菌株随之出现，近年来又出现多耐药菌株、泛耐药菌株，加之部分患者混合感染有艾滋病，导致结核病感染率、发病率和死亡率呈逐年上升趋势。所以近年来结核分枝杆菌的致病机制以及耐药性的研究成为热点。

在自然环境中细菌以浮游或者生物被膜两种形式存在，细菌生物被膜是指细菌附着于惰性或者活性实体的表面繁殖分化并分泌一些多糖基质将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。大量研究证明，结核分枝杆菌可以形成生物被膜，且生物被膜的形成与免疫逃避有密切联系，并可以显著增强结核分枝杆菌的耐药性，不同结核分枝杆菌的成膜能力与其耐药性成正相关。

进行结核分枝杆菌生物被膜检测，有助于临床和药物研究人员筛选出有效的抗结核潜在药物，为结核分枝杆菌治病机制以及耐药性研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了更精确地研究结核分枝杆菌的成膜能力和耐药性，而提供一种结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜方法。

一种结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜方法，它包括：

1）洗涤生物被膜；

2）50摄氏度干燥，在0.5-1.5%结晶紫溶液中孵育；

3）洗涤后，离心去上清，50摄氏度干燥；

4）加95%乙醇孵育，涡旋震荡，制备悬液；

5) 分光光度计测悬液A570nm的吸光度读数；

步骤1）所述的洗涤是用PBS洗涤；

步骤2）所述的结晶紫溶液为1%；

步骤2）所述的干燥时间为5min；步骤3）所述的干燥时间为30min。

本发明提供了一种结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜方法，它包括：洗涤生物被膜；50摄氏度干燥，在0.5-1.5%结晶紫溶液中孵育；洗涤后，50摄氏度干燥；加95%乙醇孵育，涡旋震荡，制备悬液；分光光度计测悬液A570nm的吸光度读数；测得的生长曲线具有良好的线型关系。可以对生物被膜进行更为精准地定量检测。

利用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜，其突出的优点是：检测方法步骤简单，对仪器的要求低；能在短时间内，条件简陋的情况下检测结核分枝杆菌生物被膜的生长情况，且较银染等其他染色方法更加经济，精准地定量检测生物被膜，对结核分枝杆菌致病机制、耐药性研究以及药物筛选具有重要的意义。

附图说明

图1 结核分枝杆菌生物被膜生长14天的照片；

图2 结核分枝杆菌生物被膜生长21天的照片；

图3 结核分枝杆菌生物被膜生长28天的照片；

图4 结核分枝杆菌生物被膜生长35天的照片；

图5结核分枝杆菌生物被膜生长42天的照片；

图6 结核分枝杆菌生物被膜结晶紫定量生长曲线图。

实施例1  结核分枝杆菌生物被膜的培养

1.参照文献（Anil K. Ojha etc，Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria）在50ml灭菌血清瓶中进行结核分枝杆菌生物被膜培养，培养8瓶。具体操作如下：a.将结核分枝杆菌标准株单菌落接入还有150ml 7H9B培养基的锥形瓶中，150rpm/min摇动培养1周，生长至对数期；b.用紫外分光光度计测菌液的OD600吸光度值为1.1，向10份菌液中加入1份新鲜7H9B培养基，测OD600吸光度值至0.9，符合OD600值为0.7-1.0；c.分装15ml苏通培养基至灭菌血清瓶中，向瓶中加入步骤b中0.5ml稀释好的菌液，拧紧瓶盖，37度静置培养。

实施例2 利用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜生长不同时期的被膜含量

分别在第14天，第21天，第28天，第35天，第42天，取1瓶生物被膜进行结晶紫染色定量，方法如下：

1）用微量移液器将生物被膜下面的培养基吸干，用2ml PBS轻轻洗2次，将浮游菌洗掉；