[发明专利]一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及人工抗原，具体指一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalate esters, PAEs）又名酞酸酯，是邻苯二甲酸的酯化衍生物，为一类常用增塑剂，可提高塑料制品的塑性和强度。PAEs为无色油状粘稠液体，易溶于有机溶剂和类酯，难溶于水，不易挥发。在塑料制品中增塑剂与塑料分子的相溶性较好，两者间没有严密的化学结合键，而是由氢键或范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质。PAEs是一类环境内分泌干扰物质，含有较弱的雌激素成分，可通过呼吸、摄食和皮肤接触进入动物和人体内，具有致突变、致畸和癌细胞增殖等危害。

目前，国内外检测PAEs的主要方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和酶联免疫吸附法（ELISA）等。仪器分析法的样品前处理步骤复杂、操作繁琐，导致检测成本高、周期长，无法满足批量样品的快速筛选和现场检测的实际需要。ELISA法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样品的纯度要求低，操作简便、快捷，在现场筛选和大量样本的快速检测中具有独特的优势。

PAEs不能直接作为抗原与抗体产生特异性反应，发展免疫分析技术的关键在于制备能诱导动物产生特定抗体的人工抗原。目前，最常见的方法是在邻苯二甲酸酯的苯环上引入活性氨基，再通过重氮法或戊二醛法与载体蛋白偶联，暴露出PAEs的侧链基团为抗原决定簇，免疫动物获得完全抗原。但是，这些方法获得的抗原只与特定PAEs产生较好的抑制效果，交叉反应率较低，得到的抗体无法应用于PAEs的通用检测。

发明内容

针对目前PAEs抗原合成技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种PAEs通用人工抗原的合成方法，本方法合成的抗原能够制备出通用的、广谱的、可用于多种PAEs检测的多克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原的合成方法，以4-硝基邻苯二甲酸为原料，经过酯化、还原和酰胺化反应合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原，再将邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原与牛血清白蛋白偶联，即得到所述的邻苯二甲酸酯类化合物通用人工抗原。

其中，以4-硝基邻苯二甲酸合成邻苯二甲酸酯类化合物通用半抗原的步骤如下，

① 在反应瓶中加入甲醇30 mL，冰浴冷却，用恒压滴液漏斗滴加9.52 g SOCl₂，撤去冰浴，在室温下搅拌1小时，加入4.32 g 4-硝基邻苯二甲酸，转入70℃油浴加热回流；反应完毕，于50℃水浴旋蒸近干，加入20 mL乙酸乙酯和10 mL蒸馏水，用饱和NaHCO₃溶液调节pH至7~8，30 mL乙酸乙酯分3次萃取，每次10 mL，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，旋蒸，得到淡黄色粉末状固体，该淡黄色粉末状固体为4-硝基邻苯二甲酸二甲酯；

② 在反应瓶中加入3.35 g 4-硝基邻苯二甲酸二甲酯、7.29 g锌粉、1.498 g NH₄Cl、甲醇30 mL，75℃恒温水浴回流反应，薄层色谱TLC监测至反应结束；趁热抽滤，除去锌粉，减压蒸馏去溶剂，加入10 mL蒸馏水，30 mL乙酸乙酯分3次萃取，每次10 mL，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，旋蒸，加入石油醚和乙酸乙酯按体积比1:8构成的混合溶剂，搅拌，析出固体，抽滤，得到橘黄色粉末状固体，该橘黄色粉末状固体为4-氨基邻苯二甲酸二甲酯；

③ 在4-氧代戊酰氯中加入适量干燥的二氯甲烷，搅拌溶解，加入0.201 g 4-氨基邻苯二甲酸二甲酯，溶解，用恒压滴液漏斗缓慢滴加至反应瓶，再加入0.304 g三乙胺，室温下搅拌，TLC监测反应进程；反应完毕，加入10 mL蒸馏水，30 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，旋蒸，得到粗产品；用乙酸乙酯重结晶，得到产物A，产物A命名为4-(4-氧代戊酰胺基)邻苯二甲酸甲酯；