[发明专利]一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于制剂材料制备和再生医学领域，具体涉及一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用。

背景技术

中枢神经系统(CNS)疾病如慢性退行性疾病以及各种损伤如脊髓损伤等，常会导致神经元、轴突及神经胶质细胞的丢失，从而造成患者的知觉或运动功能障碍甚至瘫痪。由于CNS变性或损伤后的再生能力差，难以产生新的神经元而完成自我修复，使得干细胞移植成为神经组织修复再生研究的主要趋势。第一例采用胚胎干细胞移植治疗人体脊髓损伤的临床试验已于2009年获得美国FDA批准。然而，由于取材来源、伦理道德以及免疫排斥反应等因素，使得胚胎干细胞和神经干细胞的研究应用受到了严重的限制。

骨髓间充质干细胞(BMSC)是一类以骨髓组织中含量最为丰富的多能干细胞，具有向损伤和炎症部位定向迁移的特性，可在一定条件下分化为神经元样细胞，并分泌多种在神经发育及分化过程中发挥重要作用的细胞因子。BMSC以其取材方便、体内免疫排斥和不良反应较低，以及可自体移植无伦理学争议等优点，而被视为最具前景的神经系统疾病的细胞移植来源。但是由于体内损伤部位微环境细胞外基质受到严重破坏，外源性细胞植入后存活率较低，并且损伤部位恶劣的微环境也对内源性神经细胞核轴突的再生产生抑制作用。

透明质酸是一种广泛存在于生物体细胞外基质中的粘性多糖成分，是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺构成的二糖单元重复交替连接而成的线性多糖。具有良好的生物相容性，可为细胞提供信息并有利于营养物质的供应和代谢物的排放。研究表明HA能够调节细胞的黏附、增殖、迁移和分化，在中枢神经系统的形成和发育过程中起重要作用，同时其自身尚具有一定的抗炎作用从而可一定程度上抑制神经组织内瘢痕的形成。

然而HA由于自身力学性质不佳、以及细胞识别吸附位点的相对缺乏，使其难以单独作为神经组织的生物支架，传统研究几乎均采用将其与其他材料复合应用的形式，如公告号为CN 102805880A的中国专利文献公开了一种组织工程凝胶支架材料及其制备方法和用途，该方法先将含有透明质酸或其盐的溶液与1,4-丁二酸缩水甘油醚混合，得到混合溶液，再将该混合溶液平铺使厚度为2-10mm、干燥，得到组织工程凝胶支架材料。

RGD多肽是一种存在于细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合从而促进细胞粘附的多肽，由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。如申请号为200610019493.9的中国专利文献公开了一种RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-L-乳酸)/β-磷酸三钙复合材料及其制备方法，该方法采用RGD多肽修饰磷酸三钙，可作为神经导管或多孔骨支架材料。

目前还未有RGD多肽、透明质酸以及骨髓间充质干细胞联合构建移植系统，用于神经组织修复的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统，该移植系统无毒、柔软、粘弹性好，且构建方法简单，重现性好，便于控制。

一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统，包括凝胶支架以及黏附在凝胶支架上的骨髓间充质干细胞，所述凝胶支架通过以下步骤制备获得：

(1)在交联剂存在下，透明质酸和己二酸二酰肼发生交联反应，经冷冻干燥后获得支架骨架；

按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:(2～4):(7～15)；

所述反应官能团分别是指透明质酸中的羧基、己二酸二酰肼中的伯胺基、交联剂中的肿胺基；

(2)对所述支架骨架进行脱水、活化、溶胀，利用RGD多肽对溶胀的支架骨架进行修饰，经冷冻干燥后获得所述凝胶支架。

本发明在一定的原料配比下制备获得支架骨架，使得支架骨架具备较高的孔隙率，呈现较为规则的三维网状结构，孔隙直径在80～100μm，可以很好地支持骨髓间充质干细胞的生长和聚集；并且，采用RGD多肽对支架骨架进行修饰，大大改善了骨髓间充质干细胞在凝胶支架上的粘附性，使得该凝胶支架移植系统与中枢神经组织具有更好的相容性。

具体地，所述凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)在交联剂存在下，透明质酸(HA)和己二酸二酰肼(ADH)发生交联反应，经冷冻干燥后获得支架骨架；

作为优选，按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:4:15。在该原料配比下，获得的支架骨架孔隙率最高。

作为优选，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。